鯖魚生物胺產生菌篩選、菌落總數、生長曲線測定——摘要、材料與方法
摘要：從鯖魚體內分離7株生物胺產生菌，其中3株菌可以產生色胺，4株菌可以產生2-苯乙胺，4株菌可以產生腐胺，1株菌可以產生尸胺，3株菌可以產生組胺，1株菌可以產生酪胺。組胺生成量較高的No.1菌株形態學、生理生化分析及菌種鑒定結果表明該菌株極有可能為侵肺巴斯德氏菌，可信度為99.9%。
鯖魚又名青花魚，是一種常見的可食用魚類，多見于西太平洋及大西洋海岸附近，喜群居。鯖魚平均體長30～50 cm，壽命最長可達11年，它以浮游生物及鱘魚、鱈魚和鯡魚所產魚卵為生，屬于青皮紅肉魚類。近年來先后在江蘇及天津等地發現鯖魚生物胺中毒事件。
組胺是含咪唑環化合物，在附著在魚肉中的摩氏摩根氏菌，磷發光桿菌等微生物來源的組氨酸脫羧酶（histidine decarboxylase，HDC）的作用下，使組氨酸脫去羧基而產生組胺。游離氨基酸是生物胺產生的前體物質，水產品中游離氨基酸的量和種類對氨基酸脫羧酶的活力都會產生影響。其中組胺是引起過敏性食物中毒的最主要化學物質，是人們對海水魚類安全問題關注的熱點。
生物胺產生菌普遍存在于海水魚的體表及活魚的鰓和內臟中，在魚體存活時對魚體并不產生危害。魚體一旦死亡，隨著防御系統被破壞，生物胺產生菌在適宜溫度下迅速繁殖并產生大量組胺。基于鯖魚頻繁引起生物胺特別是組胺中毒現象，本實驗通過研究篩選生物胺產生菌，對分離菌的形態特征、生物胺生成情況進行分析，為鯖魚貯藏過程中生物胺的形成及控制提供參考依據。
1、材料與方法
1.1材料、試劑與設備
1.1.1材料
冰鮮鯖魚購于廣州市海珠區下渡路水產市場，經去頭、去內臟、無菌包裝后于室溫下（18～23℃）存放備用。
1.1.2試劑
生物胺標準品：組胺（h i s t a m i n e，H I S）（≥97%）、色胺（tryptamine，TRP）（≥98%）、2-苯乙胺（2-phenethylamine，2-PHE）（≥99.5%）、尸胺（cadaverine，CAD）（≥97%）、腐胺（putrescine，PUT）（≥99%）、亞精胺（spermidine，SPM）（≥98%）、精胺（spermine，SPD）（≥97%）、酪胺（tyramine，TYR）（≥99%）、丹磺酰氯（99%）、1,7-二氨基庚烷（98%）美國Sigma公司；乙腈、甲醇、丙酮均為色譜純美國Burdick&Jackson公司；其他試劑均為化學純或分析純，購于廣州粵申化學試劑廠。
1.1.3培養基
PCA培養基（1 L）：準確稱取蛋白胨5.0 g、酵母浸粉2.5 g、葡萄糖1.0 g、瓊脂15 g，加入1 mol/L氫氧化鈉調節pH值至7.0±0.2。
生物胺篩選培養基（1 L）：準確稱取蛋白胨5.0 g、酵母浸粉5.0 g、L-組氨酸18.5 g、氯化鈉5.0 g、碳酸鈣1.0 g、瓊脂20 g和溴甲酚紫0.06 g，使用1 mol/L鹽酸調pH值至5.3±0.2。
TSA培養基（1 L）：稱取47 g干粉于1 L蒸餾水中加熱煮沸溶解，滅菌后制成平板備用。
TSBH培養基（1 L）：準確稱取TSB培養基38 g和L-組氨酸20 g，加入1 L蒸餾水，煮勻，滅菌后使用；以上培養基于1.01×105Pa高壓下121℃蒸汽滅菌15 min。
1.1.4儀器與設備
TU-1990紫外-可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司；3K30型冷凍離心機美國Sigma公司；388型立式蒸汽壓力滅菌鍋上海申安醫療器械廠；Agilent 1100高效液相色譜儀美國Agilent公司；WGP-350隔水式電熱恒溫培養箱上海華巖儀器設備有限公司。
1.2方法
1.2.1菌落總數的測定
參考盧涵等的方法測定菌落總數。取常溫貯藏0、1、2、3、4、5 d的鯖魚背部肌肉組織，無菌條件下搗碎混勻，稱取10 g置于裝有90 mL生理鹽水的錐形瓶中（內含滅菌玻璃珠），混勻。用無菌生理鹽水依次稀釋成10倍系列稀釋樣品勻液，無菌條件下進行PCA培養基平板稀釋實驗。
1.2.2菌株的分離與純化
參考楊健等的方法，將上述樣品稀釋液在無菌條件下在生物胺篩選培養基上進行平板涂布實驗，然后將涂布后的培養基置于35℃的恒溫培養箱中培養3 d，肉眼觀察生物胺篩選培養基上的菌落，藍紫色菌落即為生物胺產生菌。用接種環將培養基中的藍紫色菌落接種于TSA培養基中純化培養，35℃培養2 d。
1.2.3菌株生長狀況及生物胺生成情況
將純化后的細菌接種于TSBH培養基中，分別置于4℃和35℃環境中振蕩培養2 d，用紫外分光光度計連續測定培養液的OD605 nm值，表示各細菌的生物量。參考楊賢慶等的方法，取1 mL 35℃條件下培養48 h的發酵液，采用柱前衍生高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）對組胺（HIS）、色胺（TRP）、2-苯乙胺（2-PHE）、腐胺（PUT）、尸胺（CAD）、酪胺（TYR）、亞精胺（SPD）和精胺（SPM）8種生物胺進行測定分析，實驗重復3次。
色譜測定參數：色譜柱：Grace Smart RP-18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），柱溫40℃，流速1.0 mL/min，進樣量10μL，熒光激發波長為350 nm，發射波長為520 nm。流動相A為0.1 mol/L乙酸銨溶液，流動相B為乙腈，流動相C為超純水。梯度洗脫程序見表1。
表1梯度洗脫程序表
1.2.4生化實驗
1.2.4.1菌落形態及色澤觀察
觀察并描述單菌落在平板上的形狀、大小、邊緣、表面、隆起形狀、透明度、菌落及培養基的顏色等菌落特征。
1.2.4.2革蘭氏染色
挑取菌落，進行革蘭氏染色實驗，用顯微鏡觀察菌體的革蘭氏染色情況。
1.2.4.3菌種鑒定
挑取單菌落分別接種于3 mL質量分數0.45%無菌NaCl溶液（pH 4.5～7.0）中，混勻，配制相當于0.80～0.10麥氏單位的菌懸液，使用丹麥Biosense微生物生長動態監測系統進行菌種鑒定。
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