嗜黏蛋白阿克曼菌在硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基中的生長情況與代謝產(chǎn)物（二）
2.4聚類分析
為了更全面直觀地顯示樣本之間的關(guān)系以及代謝物在不同樣本中的表達模式差異，將VIP值前50的顯著性差異代謝物用層次聚類進行聚類分析，結(jié)果如圖8所示。聚在同一簇內(nèi)的代謝物具有相似的表達模式，可能具有相似的功能或者共同參與同一代謝過程或者細胞通路。
Akk發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物中，顯著上調(diào)的代謝產(chǎn)物有肌酸、2-哌啶酮、2-氨基-1-苯乙醇、乙酰磷酸酯、煙曲霉素、巴多昔芬、N-乙酰-L-蛋氨酸、檸檬酸鹽、甘露糖和各種多肽等，這些代謝產(chǎn)物在人體疾病的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。文獻結(jié)果表明，Akk的這些代謝產(chǎn)物是該菌在緩解腸道炎癥，治療癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病主要功能因素。
顯著下調(diào)的產(chǎn)物有：烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、煙酰胺、高三尖杉酯堿、靈芝酸、尿苷、焦谷氨酸、海藻糖、龍膽苦苷等。其中，烏頭堿是有毒植物中存在的一種毒性成分—二萜類生物堿，毒性極強，具有心臟毒性、神經(jīng)毒性、生殖毒性、胚胎毒性，同時能通過血液吸收危害肝臟、腎臟等靶器官。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)優(yōu)化培養(yǎng)基中的烏頭堿顯著下調(diào)，說明Akk在優(yōu)化培養(yǎng)基中發(fā)酵能更大程度發(fā)揮預(yù)防及治療心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肝臟疾病的作用。除此之外的Akk代謝產(chǎn)物均被發(fā)現(xiàn)有一定抗炎、抗腫瘤、抗肥胖等益生功效，但是優(yōu)化培養(yǎng)基中這些產(chǎn)物均有不同程度的下調(diào)，因此表明，補充Akk活菌制劑時應(yīng)注意其有效菌數(shù)，過多的活菌數(shù)可能帶來疾病風險。也有研究提出，補充滅活A(yù)kk可顯著改善超重/肥胖的胰島素抵抗者的多項代謝指標，且安全性良好，效果優(yōu)于Akk活菌，由此為其作為后生元提供了有效證據(jù)。
2.5 KEGG通路注釋與分析
在生物體內(nèi)不同代謝物需要相互協(xié)調(diào)行使其生物學功能，基于KEGG通路分析有助于更進一步了解其生物學功能。為了解Akk在不同培養(yǎng)基中代謝產(chǎn)物含量變化的機制，將正負離子模式下檢測到的顯著性差異代謝物整合后進行KEGG通路注釋，并根據(jù)P值選擇顯著性最高的前20條KEGG通路進行富集，富集結(jié)果以氣泡圖的形式顯示，結(jié)果如圖9所示。
富集最顯著的5個通路為蛋白質(zhì)的消化和吸收、氨酰基tRNA生物合成、膽汁分泌、ABC轉(zhuǎn)運蛋白、氨基酸生物合成。其中，蛋白質(zhì)的消化和吸收通路富集最為顯著，強調(diào)蛋白質(zhì)是Akk的第一營養(yǎng)需求，因此培養(yǎng)基優(yōu)化主要針對這一需求進行。在這些通路中，蛋白質(zhì)的消化和吸收、膽汁的分泌是Akk消化系統(tǒng)中的代謝通路，氨酰基tRNA生物合成在Akk的遺傳信息處理中發(fā)揮重要作用，ABC轉(zhuǎn)運蛋白涉及到Akk的膜運輸功能，對外界環(huán)境的信息進行處理，氨基酸生物合成則可合成多種氨基酸。除膽汁分泌通路外，其余4種代謝通路均富集到了多種氨基酸，人體所需的多種必需氨基酸包含其中，這些氨基酸均由培養(yǎng)基中的氮源即卵清蛋白和酪蛋白胨代謝得到。
富集到膽汁分泌通路上的代謝物有20種，這些代謝物包括茚地那韋、依托泊苷、普伐他汀、多西紫杉醇、阿昔洛韋、烏本苷、長春花堿等，其中茚地那韋是一種選擇性、強效和特異性的HIV蛋白酶抑制劑，目前用于治療獲得性免疫缺陷綜合征，還能顯著減輕鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的阿爾茲海默癥（AD）相關(guān)的記憶缺陷，而相關(guān)研究表明，AD大鼠模型中，Akk可減輕AD大鼠的認知障礙。依托泊苷、多烯紫杉醇、長春花堿等均為有效的抗腫瘤和抗癌藥物，可應(yīng)用于相應(yīng)的癌癥治療。此外一些研究也證實了Akk在肺癌、結(jié)直腸癌、非小細胞肺癌等的治療中發(fā)揮了重要作用。
因此表明，其膽汁分泌通路可能是Akk發(fā)揮其功效的重要通路之一。蛋白質(zhì)的消化和吸收通路中富集到了一種短鏈脂肪酸——丙酸，它除能維持腸道健康、緩解腸道炎癥外，在人體其他組織和器官中也可發(fā)揮重要作用，膳食中補充丙酸可通過抑制食欲提高胰島素敏感性，并增加能量消耗防止高脂飲食引起的肥胖。據(jù)報道，Akk在體外培養(yǎng)時主要代謝產(chǎn)物為丁酸和丙酸，而在優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵后丙酸呈現(xiàn)顯著上調(diào)，一方面說明該培養(yǎng)基更有利于Akk發(fā)揮改善腸道疾病、減肥等作用。但目前也有報道，機體內(nèi)有機酸累積與類風濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)。由此也表明，腸道中Akk活菌數(shù)量應(yīng)保持一定上限，否則會帶來不良健康影響。
Akk發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基通過影響其代謝通路，這些代謝通路產(chǎn)生代謝產(chǎn)物較硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基顯著上調(diào)，一方面表明該培養(yǎng)基組分能使Akk更好地發(fā)揮抗腫瘤、調(diào)節(jié)機體免疫、緩解腸道炎癥等益生功能，另一方面，顯著下調(diào)的代謝產(chǎn)物則從側(cè)面說明如果腸道內(nèi)Akk豐度過高可能帶來某些疾病風險，如增加骨關(guān)節(jié)炎及類風濕性關(guān)節(jié)炎等患病風險等，且如果人體本身患有腸道炎癥補充Akk活菌反而會加重病情。
結(jié)論
目前已知Akk與人體某些疾病存在重要關(guān)聯(lián)，但至今為止將其工業(yè)化高密度培養(yǎng)依然存在技術(shù)難題。本研究對硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，篩選出了適合工業(yè)化生產(chǎn)的培養(yǎng)基配方，并通過非靶向代謝組學技術(shù)比較分析了Akk發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基和硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物之間的差異，這些代謝產(chǎn)物與Akk發(fā)揮抗炎、抗癌、調(diào)節(jié)腸-腦軸和腸-肝軸等功能密切相關(guān)；將這些差異性代謝物進行KEGG通路富集，發(fā)現(xiàn)Akk的蛋白質(zhì)消化和吸收通路富集最為顯著，證明了影響該菌生長的最重要因素是蛋白質(zhì)，同時也表明以此對培養(yǎng)基進行優(yōu)化的合理性。為該培養(yǎng)基在工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用提供了依據(jù)，也為將來Akk高密度培養(yǎng)以及作為后生元的可能性提供了研究和應(yīng)用基礎(chǔ)。
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