發根農桿菌Ri質粒構建燈盞花發根最優的培養體系（二）
1.2.3葉盤法轉化
將燈盞花無菌苗葉片剪成約0.5 cm2大小的葉盤，分別置于B5、1/2B5、1/2MS、MS固體空白培養基上25℃恒溫暗培養2 d(預培養)。將部分葉盤不作農桿菌浸染處理，以作對照。其余預培養后的葉盤分別放入制備好的OD600為0.4、0.6、0.8的3種濃度的農桿菌菌液中，分別浸染5、10、15 min，撈出后吸干殘留菌液。再分別放回預培養時的B5、1/2B5、1/2MS、MS固體培養基，25℃，分別無光恒溫共培養0、1、2、3 d。之后將共培養的葉盤對應轉到含500 mg/L頭孢噻污鈉(Cef)的B5、1/2B5、1/2MS、MS固體培養基，25℃無光恒溫除菌培養10～15 d后，一般可看到葉盤邊緣傷口處有發根長出，待發根長至2～3 cm后將其剪下，分別對應在新的含500 mg/L Cef及10 mg/L潮霉素B(Hyb)的B5、1/2B5、1/2MS、MS固體培養基上進行除菌篩選培養，每15～20 d更換1次培養基。每更換1次培養基，培養基其他成分不變，抗生素Cef濃度按500 mg/L→300 mg/L→100 mg/L→0 mg/L階梯性降低，直至除菌完全。
最后統計比較不同菌液濃度(處理A—OD600=0.4；B—處理OD600=0.6；C—處理OD600=0.8)、不同浸染時間(處理a—5 min；處理b—10 min；處理c—15 min)和不同共培養時間(處理1—0 d；處理2—1 d；處理3—2 d；處理4—3 d)對葉盤發根誘導率、葉盤死亡率及染菌率等的影響，從而得出燈盞花發根最佳誘導培養條件。
1.2.4發根鑒定
取在除菌篩選培養基上仍生長良好的發根約100 mg，采用CTAB法提取總DNA，以總DNA為樣品模板，同時以C58C1菌為陽性對照，以非轉化根DNA為陰性對照，PCR鑒定毛狀根總DNA中是否含發根農桿菌C58C1 Ri質粒的rolB和rolC基因：1)primers forrolB:rolB-F:5′-CGA GGG GAT CCG ATT TGC TT-3′；rolB-R:5′-GAC GCC CTC CTC GCC TTC CT-3′。2)primers forrolC:rolC-F:5′-TCG CCA TGC CTC ACC AAC TCA C-3′；rolC-R:5′-CCT TGA TCG AGC CGG GTG AGA A-3′。3)反應體系(20μL)：ddH2O 7μL,Template DNA 1μL,Forward Primer(10μmol/L)1μL，Reverse Primer(10μmol/L)1μL,2×rTaq PCR SuperMix 10μL。4)PCR反應程序：94℃5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃40 s，35個循環；72℃5 min。凝膠成像系統下觀察DNA條帶。
1.2.5液體振蕩擴大培養
選取除菌完全且鑒定為陽性的發根，剪取約300 mg，分別放入裝有200 mL B5、1/2B5、1/2MS、MS液體培養基的三角瓶，置于搖床上，25℃避光，100 r/min振蕩培養，每周更換1次培養基并稱質量，比較不同培養基對發根生長速率的影響。
2結果與分析
結果顯示，對照組未經農桿菌浸染誘導處理的葉盤也有極少部分長出了不定根。燈盞花發根誘導流程見圖1。經農桿菌浸染處理的試驗組葉盤，因培養條件不同，表現出了不同的誘導率。具體誘導率見表1。
A.葉盤預培養;B.誘導;C.除菌篩選培養;D.液培
圖1燈盞花發根誘導流程
注：為方便統計，表中所述長出發根的葉盤數是指凡是葉盤邊緣長出了根的葉盤的數量，這些根不一定是發根，因此，誘導率也并不一定是陽性誘導率；死亡和染菌嚴重的葉盤數指培養過程中黃化死亡未能長出發根的，及雖長出了發根但染菌嚴重，無法脫菌完全的葉盤總數。
2.1發根的鑒定
按上述發根鑒定方法對脫菌完全的發根提取DNA進行PCR鑒定，其中對照組絕大部分在除菌篩選培養時已黃化死亡，少數存活的不定根PCR鑒定也均不含rolB、rolC基因，因此不是發根。試驗組則大部分是有rolB、rolC基因的陽性發根。PCR鑒定結果如圖2。陽性發根則于液體培養基中擴大培養。
M:T-2000 DNA Maker;N:陰性對照;P:陽性對照;1～10:樣品
圖2發根中rolB、rolC基因PCR鑒定結果
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