RIP 衍生物對?耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生長曲線及生物膜形成的影響（一）
耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的群體感應系統-附屬基因調節（agr）系統，調控多種毒力因子表達，其中最重要的一類毒力因子是葡萄球菌溶素。MRSA 還能夠表達一些黏附蛋白，促進細菌生物膜的形成。這些毒力因子在MRSA 侵襲性感染過程中發揮重要作用。RNAⅢ抑制肽（RIP）是agr 系統抑制劑。本研究設計合成了新的RIP 衍生物RIP1183，檢測其對MRSA 的生長和生物膜形成的影響，以及在不同時相對重要毒力因子表達的影響，探討RIP1183 抗菌、抗生物膜的作用機制。
1 材料與方法
1.1 試劑
微量RNA 提取試劑盒RNeasy Mini Kit（QIAGEN），細菌RNA 提取試劑盒RNAprep pure Bacteria Kit，反轉錄試劑盒PrimeScript Kit，Premix Taq RT-PCR 系統（TaKaRa）。異硫氰酸熒光素（FITC）、葡萄糖均購自Sigma 公司；胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養基購自北京陸橋技術有限責任公司。
1.2 菌株和藥品
MRSA（USA300）由美國國立衛生研究院（NIH）的Michael Otto 教授友情惠贈。RIP1183 由本課題組設計，委托空軍軍醫大學生物制藥教研室合成，白色疏松粉末，批號：20141001，含量：99.41%，保存條件：-20℃低溫保存。
1.3 細菌培養
按照1∶100 的比例接種MRSA（USA300）至5 mL的培養基中，37℃振蕩培養14 h，將過夜培養的細菌分別轉接至10 mL TSB 培養基 （含0.5%的葡萄糖），將細菌濃度調整至1×108CFU/mL。RIP 組加入RIP1183使其終濃度為50 μg/mL。對照組加入無菌磷酸鹽緩沖液。37℃振蕩培養，每隔2 h 測定1 次吸光度（OD）630值，監測12 h 內細菌生長情況，實驗重復3 次。
收集菌體，細菌培養操作同上，每隔2 h 吸取100 μL 菌液，12 000 r/min，4℃，離心10 min，棄去上清，收集沉淀（細菌），保存至-80℃冰箱中。
1.4 細菌生物膜
細菌過夜培養，用含有0.5%葡萄糖的TSB 培養液將菌液稀釋至1×106CFU/mL，接種于48 孔培養板中。RIP 組加入RIP1183，使藥物終濃度為50 μg/mL，對照組加入無菌磷酸鹽緩沖液。37℃濕盒中孵育48 h后，棄上清，無菌磷酸鹽洗掉浮游菌和雜質。然后用FITC（0.1 mg/mL）標記貼壁細菌，無菌磷酸鹽清洗3 次，避光4℃保存，熒光顯微鏡（Olympus，CKX41）觀察貼壁細菌并拍照。使用Image J 軟件定量分析熒光強度。
1.5 qRT-PCR
為了探討金黃色葡萄球菌不同生長時相，agr 系統的激活情況，以及RIP1183 對細菌葡萄球菌溶素和生物膜形成的影響，分別檢測細菌遲緩期（2 h）、對數期（6 h）和穩定期（10 h）16S rRNA、RNAⅢ、人類白細胞抗原（HLA）、icaA 和fnbA 基因的表達水平。
收集的細菌，按照微量RNA 提取試劑盒RNeasy Mini Kit 說明書，提取細菌總RNA。將RNA 溶于30 μL的DEPC 水，然后用反轉錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit 獲得cDNA。qRT-PCR 反應：反應體系20 μL，包括cDNA 2 μL，2×SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ10 μL，上游引物（10 μm）1 μL，下游引物（10 μm）1 μL，無菌ddH2O 6 μL。反應條件：segment 1：95℃、5 min；segment 2：95℃、10 s，55℃、30 s，40 個循環；segment 3：95℃、15 s，55℃、60 s，95℃、15 s；每個反應重復3 次。用2-ΔΔCT法計算分析各組基因相對于內參基因16S rRNA的表達量。用于檢測基因表達水平的引物序列，見表1。
表1 用于檢測基因表達水平的引物序列
1.6 統計學方法
采用GraphPad Prism Version 5.0 統計軟件對所得數據進行統計學分析，計量資料用均數±標準差（）表示，采用獨立樣本t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 RIP1183 對MRSA（USA300）生長曲線的影響
MRSA（USA300）培養在含葡萄糖的TSB 培養基中，2 h 后由遲緩期進入對數期，8 h 后進入穩定期；RIP 組加入RIP1183（50 μg/mL），MRSA（USA300）同樣是在2 h 進入對數期，8 h 后進入穩定期。與對照組比較，RIP1183 不影響細菌生長，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見圖1。
圖1 RIP1183 對MRSA（USA300）生長曲線的影響
2.2 RIP1183 對細菌生物膜形成的影響
與對照組比較，RIP 組細菌生物膜形成顯著減少（P ＜0.01）。見圖2。
RIP 衍生物對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生長曲線及生物膜形成的影響（一）
RIP 衍生物對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生長曲線及生物膜形成的影響（二）
相關新聞推薦
1、大腸桿菌噬菌體Bp4抗性菌株與其敏感菌株培養特性及耐藥性檢測（二）