利用細菌生長曲線表征芳樟醇對三文魚莓實假單胞菌MS 02的抑菌效果（一）
高通量測序（high-throughput sequencing，HTS）能直接從樣品中提取DNA，并同時對數百萬個基因樣本進行測序分析，有效地避免了傳統微生物分離、培養的繁瑣過程和可能造成的污染。HTS在檢測不可培養微生物和低豐度微生物方面有其獨到之處，為全面描述細菌群落動態、分析微生物代謝途徑與腐敗菌之間的相關性提供了可靠的方法。與傳統的Sanger法測序相比，HTS耗時更短、精準度更高、且成本更為低廉。目前，HTS已應用于食品領域的許多研究中，如傳統發酵鲅魚、雞肉、豬肉等。Cai Luyun等利用微波或遠紅外解凍紅鯛魚片并研究解凍技術對微生物多樣性的影響，發現解凍方式對微生物優勢菌群影響較小，貯藏前期假單胞菌屬是其主要菌屬，貯藏24 h以后，芽孢桿菌的比例顯著增加，也成為紅鯛魚片的優勢菌群。
芳樟醇是一些芳香植物精油，如薰衣草精油、芳樟精油的主要成分之一，常被作為芳香劑和調味劑添加到洗滌劑和食品中，每年全球總消費量超過1 000 t。芳樟醇還被美國食品和藥品管理局歸類為“公認安全”（generally recognized as safe，GRAS）物質，聯合國糧食及農業組織/世界衛生組織食品添加劑聯合專家委員會確定了芳樟醇的每日允許攝入量（acceptable daily intake，ADI）為0～0.5 mg/kgmb。芳樟醇除了簡單的調香調味功能之外，還具有抗菌、抗炎癥、抗腫瘤、抗高血壓、預防神經退行性疾病（阿爾茨海默病等）等功效。
莓實假單胞菌（Pseudomonas fragi）廣泛存在于各種冷藏食品中，已有大量文獻報道莓實假單胞菌是肉品、海產品和乳制品中的優勢腐敗菌，極易導致食品腐敗變質，且隨著時間的推移，莓實假單胞菌在食品菌相體系中的優勢地位更加明顯。鑒于前人對莓實假單胞菌的研究較少，且相關研究大多集中于畜禽肉類，水產品尤其是三文魚中莓實假單胞菌的相關報道較少見，且鮮有探究芳樟醇對三文魚源莓實假單胞菌的抑菌活性及機理的研究，因此，本實驗應用HTS分析不同貯藏期三文魚的菌相變化，再以提取自三文魚中的莓實假單胞菌MS 02為靶細菌，研究芳樟醇對其抑菌性能及作用機制。
本研究利用細菌生長曲線表征芳樟醇對莓實假單胞菌的抑菌效果，通過掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察菌體的微觀形態變化，通過測定細菌細胞膜的通透性、完整性、菌體內堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）和鈉鉀ATP酶活力來分析芳樟醇的抗菌機制，為芳樟醇作為天然抑菌劑對三文魚保鮮提供理論依據。
1材料與方法
1.1材料與試劑
三文魚購自遼寧省大連市麥德龍水產市場，原產地法羅群島。
芳樟醇（純度大于98%）上海源葉生物科技有限公司；TaqPCR Master Mix試劑盒上海生工生物工程有限公司；AKP測試盒、超微量ATP酶（Na＋K＋-ATP酶）測試盒南京建成生物工程研究所；二乙酸熒光素（fluorescein diacetate，FDA）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；平板計數瓊脂（plate count agar，PCA）培養基、LB肉湯青島海博生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.2、1×）、戊二醛北京索萊寶生物科技有限公司；氨芐青霉素國藥集團化學試劑有限公司；甲醇天津福晨化學試劑有限公司。
1.2儀器與設備
SW-CJ-2FD超凈工作臺蘇州安泰空氣技術有限公司；LRH-250A生化培養箱上海一恒科技有限公司；Victor X3酶標儀美國Perkin Elmer公司；Legend Micro21R微量冷凍離心機美國賽默飛世爾科技公司；MS-105DU電子分析天平、LE703電導率儀瑞士梅特勒托利多儀器有限公司；cs 150 gx3超速離心機、F7000熒光分光光度計日本日立公司；MLS-3030CH立式高壓蒸汽滅菌鍋日本三洋公司；THZ-D臺式恒溫振蕩箱太倉市實驗設備廠；SCIENTA-IID超聲波細胞粉碎器寧波新芝生物科技公司。
1.3方法
1.3.1三文魚樣品的預處理和高通量測序
三文魚捕撈后立即宰殺放血去內臟，經液氮速凍后空運至遼寧，取三文魚腹部魚肉，干冰冷凍保藏運輸至本實驗室。將三文魚分割成若干個質量為10 g的魚塊（2 cmh2 cmh2 cm），放入無菌培養皿內，用3層保鮮膜密封，置于冰箱內于4℃下保存，分別于第0、3、6、9、12天取樣，樣品取出后立刻放入－80℃冰箱中保存，取樣結束后將樣品送至天津諾禾致源生物信息科技有限公司進行HTS分析，樣品在干冰環境中貯運。樣品經過DNA提取、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增及純化、系統數據庫的建立及測序后，得到原始數據，處理后得到有效數據，基于有效數據進行可操作單元（operational taxonomic units，OTUs）聚類和物種分類分析。
1.3.2三文魚優勢腐敗菌的分離、純化及鑒定
選取4℃貯藏12 d的腐敗三文魚塊進行微生物菌群結構鑒定。將10 g魚肉倒入無菌蒸煮袋中，加入90 mL無菌生理鹽水，勻速拍打2 min制成菌懸液，10倍梯度稀釋后取1 mL稀釋液涂布于PCA培養基表面，每個稀釋梯度設置3個平行。選取菌落總數為30～300的平板，觀察菌落特征后，挑取平板上大小、形態、隆起程度、光澤度及顏色等不同的菌落接種于LB肉湯中，28℃振蕩培養12 h，然后在PCA培養基上劃線，于28℃培養24 h，重復2～3次，再挑取單菌落接種于LB肉湯中，28℃培養12 h，以10%（體積分數）接種量傳代培養12 h至對數生長期，最后將對數生長期菌液與等體積的50%（體積分數）甘油水溶液混勻，置于－80℃冰箱中凍存保藏菌種。
將－80℃下保藏的菌種按照10%（體積分數）的接種量加入LB肉湯中，28℃培養24 h進行活化，傳代培養兩次后，取1 mL對數生長期菌液（107CFU/mL）到1.5 mL離心管中，在室溫下6 000 r/min離心5 min，收集菌體，用100μL無菌水重懸，再使用PCR儀提取細菌DNA（94℃、40 min），隨后在室溫下以6 000 r/min離心5 min，收集上清液在－20℃下保存。制備PCR擴增體系擴增細菌DNA，50μL體系組分為：1μL DNA樣品；2μL上、下游引物（10μmol/L）；25μLTaqPCR Master Mix（2×）和20μL無菌水。PCR程序：94℃、5 min；94℃、40 s，54℃、40 s，72℃、1 min，30個循環；72℃、5 min；4℃至反應完成。
將PCR擴增產物送至上海生工生物工程股份有限公司檢測基因序列。將測序得到的基因序列與NCBI數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中已知微生物基因序列進行BLAST比對分析，采用MEGA 5分析16S rRNA結果，采用Neighor-Joining法構建系統發育樹。
1.3.3芳樟醇對莓實假單胞菌的抑菌性測定
1.3.3.1芳樟醇最小抑菌濃度的測定
采用96孔板稀釋法測定芳樟醇對莓實假單胞菌MS 02的最小抑菌質量濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。將適量芳樟醇溶解于50%（體積分數，下同）甲醇溶液，配制質量濃度為8.00μg/mL的芳樟醇母液，采用二倍梯度稀釋法用50%甲醇溶液稀釋制得質量濃度分別為4.00、2.00、1.00、0.50μg/mL的芳樟醇溶液備用。按照100μL/孔向96孔細胞培養板中加入活化兩次后處于對數生長期的菌液（107CFU/mL），再分別按照100μL/孔加入不同質量濃度的芳樟醇溶液（終質量濃度分別為4.00、2.00、1.00、0.50、0.25μg/mL），分別以等體積的50μg/mL氨芐青霉素、50%甲醇溶液作為陽性對照和空白對照，每組3個平行。將96孔板置于28℃細菌培養箱培養12 h，再用酶標儀于595 nm波長處測定光密度值OD595 nm，選擇OD595nm低于陽性對照組的最低質量濃度作為芳樟醇對莓實假單胞菌的MIC。
1.3.3.2莓實假單胞菌MS 02生長曲線的測定
采用抑菌曲線法評價芳樟醇對莓實假單胞菌MS 02的抑菌效果。取－80℃下保藏的莓實假單胞菌MS 02菌種，參考1.3.2節方法進行活化，傳代培養兩次后吸取500μL對數生長期的菌懸液（107CFU/mL）加入到25 mL LB肉湯當中，充分振蕩均勻后再分別按照終質量濃度MIC、2 MIC加入芳樟醇溶液，以等體積50%甲醇溶液作空白對照，在28℃、160 r/min的搖床中培養24 h，每隔2 h取樣，使用酶標儀測定菌液595 nm處的光密度值OD595 nm。
1.3.3.3莓實假單胞菌MS 02形態觀察
采用SEM觀察莓實假單胞菌MS 02細胞形態變化。取－80℃下保藏的莓實假單胞菌MS 02菌種，參考1.3.2節方法進行活化，傳代培養兩次后向對數生長期的菌懸液（107CFU/mL）中加入芳樟醇，使菌懸液中芳樟醇的終質量濃度為MIC和2 MIC，以等體積50%甲醇溶液為空白對照。在28℃、160 r/min的搖床中培養6 h后，6 000 r/min、4℃離心10 min收集菌體。以5 mmh5 mm的鋁片作承載物，將菌體置于質量分數2.5%的戊二醛溶液中固定4 h，再用無菌PBS洗滌3次，隨后依次以體積分數30%、50%、70%、90%乙醇溶液和無水乙醇進行梯度洗脫，每級靜置15 min，將試樣室溫放置12 h使其完全干燥后噴金觀察細胞形態。
1.3.3.4電導率的測定
取活化兩次培養至對數生長期的莓實假單胞菌液，8 000 r/min離心10 min，收集菌體，用PBS洗滌3次后制得重懸菌液（107CFU/mL），分別加入終質量濃度為MIC和2 MIC的芳樟醇溶液，以等體積50%甲醇為空白對照。于搖床中培養6 h，每小時取樣測電導率。
1.3.3.5細胞膜通透性測定
通過FDA染色實驗研究芳樟醇對莓實假單胞菌MS 02細胞膜通透性的影響。將活化兩次培養至對數生長期的菌液6 000 r/min、4℃離心15 min，收集菌體并重懸于PBS中，調整菌懸液濃度為107CFU/mL，再分別加入終質量濃度為MIC和2 MIC的芳樟醇，以等體積50%甲醇為空白對照。搖床培養12 h，取各組菌懸液于6 000 r/min、4℃離心10 min收集菌體，用PBS洗滌2次后收集菌體，加入250μL FDA-丙酮溶液（2 mg/mL）。常溫下放置20 min后用PBS洗滌3次，8 000 r/min、4℃離心10 min，收集菌體并重懸于PBS中，用熒光分光光度計在激發波長為297 nm、發射波長為527 nm條件下測定樣品的FDA熒光強度，以表征細胞膜通透性。
1.3.3.6細胞膜完整性測定
按1.3.3.5節的方法制備重懸液（107CFU/mL）并分別加入終質量濃度為MIC和2 MIC的芳樟醇，以等體積50%甲醇為空白對照，分別在28℃、160 r/min搖床中培養6 h，每3 h取1 mL的菌懸液，以6 000 r/min，4℃離心10 min，上清液過0.22μm濾膜過濾。取200μL濾液于96孔板中，使用酶標儀于260 nm波長處測定其光密度值OD260 nm，每次實驗3個平行。
1.3.3.7胞內酶活力測定
將活化兩次培養至對數生長期的菌液以6 000 r/min、4℃離心15 min，收集菌體并重懸于PBS中，調整菌懸液濃度為107CFU/mL，再分別加入終質量濃度為MIC和2 MIC的芳樟醇，以等體積50%甲醇為空白對照。搖床中培養6 h，離心收集菌體，加入PBS重懸，冰水浴超聲破碎菌體，每次超聲時間為5 s，間隔10 s，重復4次。參照AKP試劑盒說明書方法，測定AKP活力。參照超微量ATP酶試劑盒說明書測定鈉鉀ATP酶活力。
1.4數據處理與統計分析
實驗設置3個平行，實驗結果用平均值±標準差表示。采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，采用Tukey檢驗進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。采用Origin 8.5軟件作圖。
利用細菌生長曲線表征芳樟醇對三文魚莓實假單胞菌MS 02的抑菌效果（一）
利用細菌生長曲線表征芳樟醇對三文魚莓實假單胞菌MS 02的抑菌效果（二）
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