大腸埃希菌的菌落數范圍、貯藏條件、活性及性狀的穩定性【實驗】
摘要：大腸埃希菌在4°中貯藏，其作為實驗菌的活性。連續31天進行大腸埃希菌計數和特征實驗，進而驗證其數量及性狀的穩定性。結果表明，在連續31天的實驗中，大腸埃希菌的菌落數范圍在1.5×109cfu/ml～8.7×109cfu/ml，且菌落大小、形態特征、指示反應等情況均體現出該菌種應有特性。實驗證明，在4°冰柜貯藏條件下，大腸埃希菌能夠作為對照菌進行控制菌檢查法實驗。
依據《中華人民共和國藥典》2015版，非無菌產品微生物限度檢查中的控制菌檢查法，需進行陽性對照試驗，每次試驗均需要加入不大于100cfu的對照菌。依據藥典指導原則，菌種可采用低溫冷凍干燥、液氮貯存、超低溫冷凍（低于-30℃）等保存方法。使用以上方法保存菌種，則需在每次實驗前都要進行菌種活化和計數實驗，進而配制不大于100cfu的加菌量。本公司藥品均進行微生物限度檢查，其中含有大腸埃希菌項目。為提高檢驗效率，尋找適宜的菌種貯藏方法，同時結合本實驗室實際情況，將大腸埃希菌經復蘇后接種至胰酪大豆胨液體培養基中，24h菌種活化后，4°C冰柜里貯藏。隨后每日進行菌種數量及性狀驗證，為進行大腸埃希菌的貯藏提供有益的科學探討。
1材料與方法
1.1儀器與材料
BPX-272型電熱恒溫培養箱;YSQ-LS-75SII型立式壓力蒸汽滅菌器;生物安全柜;大腸埃希菌[CMCC（B）44102]購自中國食品藥品檢定研究院;實驗所用培養基。
1.2實驗方法
1.2.1菌液制備：復蘇后的大腸埃希菌菌種（不超過5代）移至胰酪大豆胨液體培養基置培養箱中30～35°C培養24h，培養后貯藏至4°C冰柜。
1.2.2菌種計數：取1ml菌液用pH7.0蛋白胨緩沖液逐級稀釋至10-10，取各級稀釋菌懸液1ml，置直徑90mm的無菌平皿中，注入15～20ml溫度不超過45°C熔化的胰酪大豆胨瓊脂培養基，混勻，凝固，倒置培養。30～35°C培養24h，然后用μCount3D微生物計數儀計數。
1.2.3性狀驗證：10-8稀釋級菌液大腸埃希菌接種于麥康凱液體培養基（42～44°C培養24h）和麥康凱瓊脂培養基（30～35°C培養24h）中，觀察培養基上大腸埃希菌生長情況。
2實驗結果
2.1菌種計數實驗結果
由表1可以看出，大腸埃希菌在4°C冰柜里貯藏，連續31天的菌落數范圍在1.5×109cfu/ml～8.7×109cfu/ml之間。
2.2性狀驗證實驗結果
由表2可以看出，大腸埃希菌在4°C冰柜里貯藏，連續31天取菌液量均不大于100cfu，加入麥康凱液體培養基和麥康凱瓊脂培養基中，培養基體現的菌落大小、形態特征、指示反應等情況均體現出大腸埃希菌應有特性（+表示）。
綜上，將大腸埃希菌在4°C冰柜里貯藏，連續31天進行計數和性狀實驗。結果表明，取10-8稀釋級菌液，每ml菌液量均不大于100cfu，這可用于大腸埃希菌檢測陽性對照試驗的加菌量，無需每次進行驗證。同時，每ml10-8稀釋級菌液也能夠表現出大腸埃希菌應有特性。由此證明，每次進行大腸埃希菌實驗，可直接用貯藏菌液稀釋至10-8，取1ml作為陽性對照實驗的加菌量。
3討論
藥品微生物限度檢查是控制藥品質量的一個重要檢查項目，其中控制菌檢查是必須進行的檢驗項目。控制菌檢查過程中，需要添加不大于100cfu陽性菌進行陽性對照實驗。按照冷凍法活化新鮮菌種，進而制備試驗菌，其工作量較大，周期較長。現采用4°C冰柜貯藏大腸埃希菌菌液，每次可以直接進行稀釋使用，提高工作效率，同時也可保障檢驗的順利進行。本文只對大腸埃希菌進行實驗，其他菌種（銅綠假單胞菌、沙門菌等）未進行相關實驗，故是否能應用于所有控制菌實驗還需進一步研究。