藜麥和藍(lán)靛果酵母菌株篩選、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)及混菌液態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化（二）
1.2.3酵母菌篩選及發(fā)酵條件確定
1.2.3.1發(fā)酵菌種及時(shí)間選擇
以藜麥-藍(lán)靛果復(fù)合發(fā)酵液中SOD活力和活菌數(shù)為雙指標(biāo)，在初始裝瓶量30 mL、pH5.0、接種量為0.20%條件下，接種BA、DE、YE和Sce菌液于藜麥-藍(lán)靛果復(fù)合清汁中，30℃下分別發(fā)酵8、16、24、32、40 h。
1.2.3.2接種量選擇
以藜麥-藍(lán)靛果復(fù)合發(fā)酵液中SOD活力和活菌數(shù)為雙指標(biāo)，在初始裝瓶量30 mL、pH5.0條件下，接種0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%酵母菌。
1.2.3.3裝瓶量選擇
以藜麥-藍(lán)靛果復(fù)合發(fā)酵液中SOD活力和活菌數(shù)為雙指標(biāo)，在初始裝瓶量30 mL、pH5.0、接種量為0.20%條件下，100 mL錐形瓶中分別裝10、20、30、40、50 mL藜麥-藍(lán)靛果復(fù)合清汁后接種酵母菌，發(fā)酵16 h。
1.2.4活菌數(shù)的測(cè)定
酵母菌采用血球計(jì)數(shù)板法計(jì)數(shù)；乳酸菌采用平板法計(jì)數(shù)。
1.2.5 SOD活力的測(cè)定
按照超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒說明書方法測(cè)定。
1.2.6乳酸菌篩選及發(fā)酵條件確定
1.2.6.1乳酸菌生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酸性能的測(cè)定
將乳酸菌在其最適條件下培養(yǎng)，每隔4 h取樣，使用酶標(biāo)儀測(cè)量其OD值繪制生長(zhǎng)曲線，使用精密pH計(jì)測(cè)定pH繪制產(chǎn)酸曲線。
1.2.6.2發(fā)酵菌種及時(shí)間選擇
以藜麥-藍(lán)靛果復(fù)合發(fā)酵液中活菌數(shù)和SOD活力為雙指標(biāo)，在初始pH5.0、發(fā)酵溫度37℃條件下，接種量為3%的LA、LP、LR和S菌液于藜麥-藍(lán)靛果復(fù)合清汁中，37℃下分別發(fā)酵8、16、24、32、40 h。
1.2.6.3接種量選擇
以藜麥-藍(lán)靛果復(fù)合發(fā)酵液中SOD活力和活菌數(shù)為雙指標(biāo)，在初始pH5.0、發(fā)酵溫度37℃條件下，分別接種1%、2%、3%、4%、5%菌液，L1、L2、L3發(fā)酵24 h、L4發(fā)酵16 h。
1.2.6.4復(fù)配比例選擇
以藜麥-藍(lán)靛果復(fù)合發(fā)酵液中SOD活力和活菌數(shù)為雙指標(biāo)，在初始pH5.0、發(fā)酵溫度37℃條件下，將上述兩種最優(yōu)乳酸菌按1:3、1:2、1:1、2:1、3:1比例接種，分別發(fā)酵24 h。
1.2.7復(fù)配菌種發(fā)酵藜麥-藍(lán)靛果復(fù)合發(fā)酵液工藝優(yōu)化
1.2.7.1單因素實(shí)驗(yàn)
藜麥-藍(lán)靛果復(fù)合清汁初始pH5.0，原料復(fù)配比例為1:1，添加6%白砂糖，滅菌后先接種0.02%酵母菌30℃預(yù)發(fā)酵16 h，再接種2%復(fù)配乳酸菌37℃發(fā)酵24 h，測(cè)定藜麥-藍(lán)靛果復(fù)合發(fā)酵液SOD活力和GABA含量。固定其它條件，分別考察初始pH（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5）、發(fā)酵溫度（26.5、30.0、33.5、37.0、40.5℃）、原料復(fù)配比例（1:5、1:3、1:1、3:1、5:1）、白糖添加量（4%、6%、8%、10%、12%）對(duì)藜麥-藍(lán)靛果復(fù)合發(fā)酵液SOD活力、GABA含量的影響。
1.2.7.2響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)
利用Design-Expert 10軟件中Box-Behnken模型，以藜麥-藍(lán)靛果復(fù)合發(fā)酵液SOD活力為響應(yīng)值，進(jìn)行白糖添加量、復(fù)配比例（藜麥清汁:藍(lán)靛果果汁）、接種量、發(fā)酵溫度4個(gè)單因素對(duì)藜麥-藍(lán)靛果復(fù)合發(fā)酵液SOD活力的響應(yīng)面分析，優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)。試驗(yàn)因素水平如表1所示。
表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平
1.2.8 GABA含量測(cè)定
參考湯彩云等的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，藜麥-藍(lán)靛果復(fù)合發(fā)酵液的GABA質(zhì)量濃度測(cè)定方法與標(biāo)準(zhǔn)品相同，將測(cè)得的吸光度值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=2.1796x+0.0553，R2=0.9995，求出GABA的質(zhì)量濃度，即為藜麥-藍(lán)靛果復(fù)合發(fā)酵液的GABA含量。
1.3數(shù)據(jù)處理
所有試驗(yàn)重復(fù)3次，采用SPSS 25進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Design Expert 10中Box-Behnken模型進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析、GraphPad Prism 9軟件作圖。
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