?4株金黃色葡萄球菌噬菌體形態、生物學特性、生長曲線及基因組特征（一）
金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，SA）是一種常見的食源性致病菌，廣泛存在于水、空氣、人和動物的皮膚等環境中。它可以引起傷口感染，誘發各種炎癥，甚至污染食品和食用農產品，導致食物中毒事件的發生。使用抗生素（如氨芐西林、卡那霉素和萬古霉素等）來預防和控制SA是最直接有效的方法，但是過度使用抗生素會使金葡菌產生耐藥菌株，對人類和動物健康造成危害，甚至對生態環境安全構成威脅。因此，尋找可代替抗生素治療的生物制劑非常重要。
噬菌體是細菌的病毒，能夠專一性地裂解宿主細菌，作用機理明確。噬菌體對宿主細菌具有專一性能夠直接攻擊并殺害相應致病菌，并且具有易于篩選、數量龐大、成本低廉的優點。最重要的是用于人體和動物較為安全，不會導致菌群出現耐藥性，甚至可以殺死耐藥菌，適合用于食品中多重耐藥SA的控制。目前，一些基于噬菌體的產品已經在市場上上市，如ListexTMP100和ListShieldTM，它們的安全性得到美國食品和藥物管理局（FDA）的認可，并被美國農業部（USDA）批準可以作為抗菌加工助劑，用于食品抗菌。噬菌體根據是否能進行溶原途徑的生活史分為烈性噬菌體和溫和噬菌體，研究表明烈性噬菌體和溫和噬菌體均具有控制SA生長的潛力。Ngassam-Tchamba等分離的三株烈性噬菌體（Romulus、Remus和ISP）在體外對與牛乳腺炎相關的SA具有良好裂解活性。分離的溫和噬菌體JS02對SA表現出較強的清除能力，并且能抑制SA生物膜的形成。將溫和噬菌體SA13隨機缺失突變后的突變噬菌體SA13m應用于牛奶中抑制SA，結果顯示金葡菌在冰箱溫度（4℃）和室溫（25℃）下均降低至不可檢測的水平。Al-Anany等研究發現溫和噬菌體HK97與亞抑菌濃度的抗生素環丙沙星聯合使用，對SA具有良好清除效果。然而，尚未有研究系統性比較溫和噬菌體和烈性噬菌體在形態、生物學特性以及基因組組成上的差異。
本研究分離出4株SA的噬菌體（包括2株烈性噬菌體和2株溫和噬菌體），利用透射電鏡觀察其形態特征差異，隨后對所分離噬菌體的效價、宿主譜、耐酸堿能力、熱穩定性、一步生長曲線、最佳感染復數（Multiplicity of Infection，MOI）值等生物學特性進行比較研究，最后通過全基因組測序比較分析烈性噬菌體和溫和噬菌體基因組特征。本文通過比較溫和噬菌體和烈性噬菌體在形態、生物學特性以及基因組組成的差異，為篩選更加高效的噬菌體作為生物抑菌劑，用于控制食品加工過程中金葡菌污染奠定理論基礎和數據支持。
1、材料與方法
1.1菌株及樣品來源
47株SA菌株YZUsa1-YZUsa47分離自江蘇省內養豬場；ATCC 29213購自北京百歐博偉生物技術有限公司；3株SA菌株MRSA 85/2082、MRSA JCSC4744和MRSA WZ153來自揚州大學生物危害因素防控重點實驗室；霍氏腸桿菌（Enterobacterhormaechei）Eh-YZU05分離自豬糞便，單核增生性李斯特菌（Listeriamonocytogenes）ATCC 1911、腸炎沙門氏菌（Salmonellaenteritidis）CICC 21513、大腸桿菌（Escherichiacoli）CICC 10664及最小弧菌（Vibrio mimicus）CICC 21613購自CICC菌種保藏中心。
1.2主要試劑和儀器
盧里亞-貝爾塔尼（Luria-Bertani，LB）培養基，購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司；Baird-Parker瓊脂基礎，購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司；腦心浸出液肉湯（Brain Heart Infusion，BHI），購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司；7.5%氯化鈉肉湯，購自廣東環凱微生物科技有限公司；絲裂霉素C購自上海麥克林生物公司。
SW-CJ-1F型無菌操作臺，蘇州凈化設備制造有限公司；JEM-1200EX型透射電鏡，日本電子株式會社；HC-2066型高速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；H/T16MM型冷凍離心機，北京博勱儀器有限公司；BDY-2012型恒溫搖床，上海百典儀器設備有限公司。
1.3噬菌體分離
1.3.1烈性噬菌體分離
利用SA菌株ATCC 29213作為宿主進行SA噬菌體分離。采集揚州市內污水樣品500 mL，污水樣品的前處理過程以及噬菌體分離純化過程參照Chang等的方法進行。用8 000 r/min的高速離心機離心10 min以除去雜質，之后使用0.45μm和0.22μm濾器過濾除菌后，得到噬菌體原液。將3 mL 2×的LB培養基培養液和100μL培養至對數生長期的SA菌株ATCC29213加入處理后的污水中，在37℃的溫度下搖床培養8 h以上。將培養后的培養物經過離心、過濾得到原液，并保存在4℃的冰箱。
1.3.2溫和噬菌體分離
挑取純化后的金葡菌YZUsa13和YZUsa14單菌落于LB液體培養基中，于37℃下搖床培養12 h，調整菌液濃度為2×107CFU/mL。分別在LB培養基中加入167μL濃度為0.3 mmol/L的絲裂霉素C和菌液，置于37℃下搖床培養6 h，每隔1 h取1 mL通過0.22μm濾膜后，與菌液各100μL加入10 mL離心管中，利用層平板法測定噬菌體滴度。
1.4透射電鏡觀察
噬菌體的形態學觀察：先將噬菌體液進行濃縮，然后在200目碳涂層銅網上滴加20μL的濃縮后的噬菌體（1010PFU/mL）懸浮液，充分吸附約15 min后取出銅網使其自然干燥2～3 min。然后用2%（m/V）的磷鎢酸鈉（pH值為7.6）溶液染色2 min后，使用透射電鏡（TEM，Hitachi H600A）觀察噬菌體形態。
1.5噬菌體宿主譜的測定
噬菌體的宿主譜采用空斑法進行測定，通過雙層平板法將100μL菌液（108CFU/mL）和5 mL的LB半固體培養基混勻后倒在LB固體培養基上，自然干燥后取10μL噬菌體培養液（MOI=100）滴在表面，倒放在37℃恒溫箱中培養。每組實驗平行重復3次。
1.6生物學特性測定
1.6.1最佳感染復數的測定
最佳MOI的測定方法：將菌液濃度調整至1×106CFU/mL，按照噬菌體和宿主菌的不同比例（0.000 1、0.001、0.01、0.1、1、10和100）將噬菌體和宿主菌混勻后37℃搖床培養8 h后，于8 000 r/min條件下離心10 min，過濾并測定效價，效價最高的比例即為最佳MOI。每組做三次平行實驗。
1.6.2一步生長曲線（One-stepGrowth）的測定
一步生長曲線的測定方法：將噬菌體和108CFU/mL宿主菌按照最佳MOI混合，37℃靜置培養7 min后8 000 r/min離心10 min，棄上清后加入5 mL的LB培養基重懸沉淀，放在37℃培養箱中培養。分別于不同時間點（0、5、10、15、30、45、60、75和90 min）或（0、10、20、30、40、50、60、75、90、105、120、135、150、165、180、200、220和240 min）取100μL梯度稀釋后與宿主菌各100μL倒雙層平板。每組實驗平行重復3次。
1.6.3耐酸堿性實驗
噬菌體的耐酸堿性實驗：分別取1 mL噬菌體于若干10 mL的離心管中，分別加入1 mL pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的SM緩沖液中，37℃下作用2 h后測定效價。
1.6.4熱穩定性實驗
噬菌體熱穩定性實驗：取1 mL效價約為108PFU/mL的噬菌體于試管中并放在40、50、60、70℃的恒溫金屬浴中依次作用20、40和60 min后測定效價。
1.7基因組測序及分析
對噬菌體SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14的全基因組序列進行測定和分析。噬菌體基因組DNA提取參照文獻中所述方法。分別采用瓊脂糖凝膠電泳和Qubit®dsDNA HS分析試劑盒（Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）對噬菌體基因組DNA進行定性定量。
通過Illumina HiSeq平臺（Illumina，SanDiego，CA，USA）對噬菌體基因組序列進行測定，插入片段大小為500 bp。使用FGENESB（http://www.softberry.com）、GeneMarkS和Glimmer v3.02軟件對開放閱讀框（Open Reading Frames，ORFs）進行預測。通過InterProScan（http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/）和BLASTp對ORFs進行注釋。將基因組信息上傳至NCBI網站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14的GenBank編號分別為OP432864、MW864252、ON229621和ON220160。
1.8噬菌體系統進化樹構建
截至2021年4月，GenBank數據庫中記錄192個金黃色葡萄球菌噬菌體基因組序列。本研究通過軟件kSNP3 v3.0對噬菌體SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13、SAPYZU-SapM14和上述192個SA噬菌體基因組序列的單核苷酸多態性（Single-Nucleotide Polymorphisms，SNPs）進行解析并構建系統進化樹。以噬菌體ErwiniaphagephiEa2809作為外組噬菌體，并使用iTOL進行注釋。
1.9數據分析
實驗數據表示為平均值±標準差（Mean±SD，n=3），每組實驗重復3次，取平均值。實驗數據中點線圖、柱狀圖由Origin 2023軟件繪制完成。
4株金黃色葡萄球菌噬菌體形態、生物學特性、生長曲線及基因組特征（一）
4株金黃色葡萄球菌噬菌體形態、生物學特性、生長曲線及基因組特征（二）
4株金黃色葡萄球菌噬菌體形態、生物學特性、生長曲線及基因組特征（三）
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