不同質量濃度水飛薊賓對6種標準菌株的生長抑制曲線（一）
摘要：目的探討水飛薊賓及同分異構體的體外抗菌譜及水飛薊賓與臨床常用抗生素的聯合抑菌效應。方法用微量肉湯稀釋法測定水飛薊賓及同分異構體對臨床感染常見細菌的6種標準菌株和6種臨床分離菌株（74株）的最低抑菌濃度（MIC）。用平板菌落計數法測定不同質量濃度水飛薊賓對6種標準菌株的生長抑制曲線。
用棋盤微量肉湯稀釋法進行水飛薊賓與臨床常用抗生素的聯合藥敏試驗，計算聯合抑菌指數（FIC），判定水飛薊賓與抗生素的聯合抑菌效應。結果水飛薊賓對表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和屎腸球菌標準菌株的MIC為50～400μg/mL，對大腸埃希菌和銅綠假單胞菌標準菌株的MIC均＞400μg/mL；對表皮葡萄葡萄球菌臨床分離菌株的MIC分別為100、200、400、＞400μg/mL，對金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和屎腸球菌臨床分離菌株的MIC分別為400、＞400μg/mL；對大腸埃希菌和銅綠假單胞菌臨床分離菌株的MIC均＞400μg/mL。水飛薊賓其他同分異構體對6種標準菌株的MIC為≥400μg/mL。水飛薊賓對表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和屎腸球菌標準菌株的生長曲線都有明顯抑制作用，抑制效果隨藥物質量濃度增加而增加，對大腸埃希菌和銅綠假單胞菌標準菌株的生長曲線無影響。水飛薊賓與青霉素/紅霉素聯用對革蘭陽性試驗菌的FIC以0.5＜FIC≤1和1＜FIC≤2為主，水飛薊賓與環丙沙星或慶大霉素聯用對革蘭陰性試驗菌的FIC以FIC＞2或1＜FIC≤2為主。結論水飛薊賓對革蘭陽性菌有較好的抑菌活性，其中對表皮葡萄球菌抑菌活性最強。水飛薊賓的抑菌活性明顯高于其他同分異構體。水飛薊賓與青霉素/紅霉素聯用主要為相加和無關作用，與環丙沙星或慶大霉素聯用主要為拮抗或無關作用。
隨著抗生素的廣泛使用，細菌耐藥性給臨床抗感染治療帶來嚴峻挑戰，已經成為21世紀全球公共衛生面臨的重大問題[1-5]。相比耐藥菌的迅速增加，近年來抗菌藥物的研發速度明顯減慢，未來臨床可能會出現無藥可用的局面。目前人們已將視線投向天然藥物[6]，中草藥因其來源廣泛、價廉、毒副作用小及不易出現耐藥性，而成為新抗菌藥物研發的熱點[7-8]。
中藥抑菌殺菌的有效成分多樣，包括有機酸、揮發油、生物堿、多糖類、黃酮類、萜類、醌類等，從植物花、葉、種子、果實、根、莖中提取的黃酮類化合物具有直接抑菌、協同抑菌及抑制細菌毒性等作用，其抑菌活性與分子結構有關，自然界中不同來源及不同種類的黃酮類化合物分子結構各異，抑菌譜和抑菌活性各不相同[9-11]。水飛薊種子皮的初級總提取物水飛薊素為黃酮本質素類化合物，包括紫杉醇、紫杉醇衍生物、水飛薊亭、水飛薊寧、水飛薊賓A、水飛薊賓B、異水飛薊賓A、異水飛薊賓B和脫氫水飛薊賓9種成分，主要活性成分為水飛薊賓、異水飛薊賓、水飛薊亭和水飛薊寧4種同分異構體，其中水飛薊賓含量最高（60%～70%），并對金黃色葡萄球菌有抑制作用[12]。中藥成分復雜、作用機制廣泛，分離純化得到有效單體并研究其藥理作用是現代中藥開發應用的基礎。目前水飛薊賓作為保肝藥物廣泛應用于臨床[13-14]。但關于水飛薊賓及同分異構體的抑菌譜及其與抗生素聯合抑菌效應的報道極少。本實驗采用微量肉湯稀釋法測定最小抑菌濃度（MIC）和聯合藥敏實驗，探討水飛薊賓及同分異構體的抑菌譜及其與臨床常用抗生素的聯合抑菌效應，為新抗菌藥物的開發和研制提供科學依據，為黃酮類藥物的進一步開發應用提供基礎。
1、材料
1.1藥物與試劑
水飛薊賓（質量分數＞98%，批號Y-024-150422）、水飛薊寧（質量分數＞98%，批號S-112-170418）、異水飛薊賓（質量分數＞98%，批號Y-138-161201）、水飛薊亭（質量分數＞97%，批號S-111-170418）均購自成都瑞芬思生物科技有限公司；青霉素、紅霉素、慶大霉素和環丙沙星標準物質購自中國食品藥品檢定研究院；M-H肉湯培養基粉末購自青島高科園海博生物技術有限公司；營養瓊脂購自北京奧博星生物技術有限責任公司；Costar®96孔細胞培養板為美國Corning-Costar產品。
1.2菌株
1.2.1標準菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923、表皮葡萄球菌ATCC12228、糞腸球菌ATCC29212、屎腸球菌ATCC19434、大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853，購自廣東省食品微生物安全工程技術研究開發中心-菌種保藏中心。
1.2.2臨床分離菌株金黃色葡萄球菌15株、表皮葡萄球菌10株、糞腸球菌4株、屎腸球菌15株、大腸埃希菌15株、銅綠假單胞菌15株，均收集于四川省中醫院。
2、方法
2.1水飛薊賓及同分異構體藥液配制
用二甲基亞砜將水飛薊賓及同分異構體樣品溶解并配成80 mg/mL的母液，濾過除菌后4℃保存備用。使用時先用無菌MH肉湯將母液稀釋100倍，再用MH肉湯進行倍比稀釋為800、400、200、100、50、25、12.5μg/mL。
2.2抗生素溶液配制
用冰醋酸溶解紅霉素，用蒸餾水溶解青霉素、環丙沙星、慶大霉素，配成800μg/mL母液，濾過除菌后4℃保存備用，使用時用無菌MH肉湯倍比稀釋。
2.3細菌懸液制備
將菌株復蘇于血瓊脂平板上，37℃培養24～48 h，挑取單個純菌落接種于無菌MH肉湯培養基中，37℃（100 r/min）振搖培養至對數生長期，用無菌MH肉湯稀釋菌懸液至0.5麥氏濁度（1.5×108 CFU/mL），再用MH肉湯調節菌液濃度為1.0×106～1.0×107 CFU/mL。
2.4 MIC測定
采用美國臨床和實驗室標準協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的微量肉湯稀釋法測定各受試樣品的MIC。
2.4.1水飛薊賓及同分異構體對標準菌株的MIC測定取96孔板，每孔加入100μL菌懸液和100μL不同質量濃度的供試藥液（水飛薊賓、異水飛薊賓、水飛薊亭和水飛薊寧），使藥物終質量濃度分別為400、200、100、50、25、12.5、6.25μg/mL，37℃（100 r/min）振搖培養18～24 h，以肉眼觀察無細菌生長、培養液清澈的最低藥物質量濃度為MIC。同時設陰性對照（無菌MH肉湯）和陽性對照（細菌＋無菌MH肉湯）。實驗重復3次，取平均值。
2.4.2水飛薊賓對臨床分離菌株的MIC測定按“2.4.1”項方法操作測定。
2.4.3抗生素對標準菌株和臨床分離菌株的MIC測定革蘭陽性菌（金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌）選用青霉素、紅霉素，革蘭陰性菌（大腸埃希菌、銅綠假單胞菌）選用慶大霉素、環丙沙星。按“2.4.1”項方法操作測定。
2.5水飛薊賓對標準菌株的生長抑制曲線檢測
取96孔板，每孔加入100μL菌懸液和100μL不同質量濃度的水飛薊賓藥液，使水飛薊賓終質量濃度分別為0.5 MIC、1 MIC、2 MIC；菌陽性對照組用無菌MH肉湯替代藥液（菌懸液＋無菌MH肉湯）。放37℃孵育箱中培養，分別于培養0、2、4、6、8、10、12、14、16 h取樣進行平板菌落計數（按國標GB/T5750.12-2006）。將菌懸液按10倍遞增稀釋后，取目標濃度菌懸液1 mL加入一次性無菌平皿，再加入15 mL 50℃左右營養瓊脂，立即混勻，待凝固后于37℃培養18～24 h，肉眼觀察并記錄每個平皿的菌落形成單位（colony forming unit，CFU）。以菌落數為30～300的平板，計算每毫升原始樣品中所含細菌總數（1 mL原菌懸液中的活菌數＝全平板CFU×稀釋倍數），每個濃度菌液同時做3個平行平板，CFU取3個平板的均值。當空白對照（只加無菌MH肉湯＋營養瓊脂，不加菌懸液）平板上無細菌生長時，實驗結果有效。以菌落總數為縱坐標，培養時間為橫坐標繪制生長抑制曲線。
2.6水飛薊賓與抗生素對標準菌株和臨床分離菌株的聯合藥敏實驗[15]
采用棋盤法。將水飛薊賓及臨床常用抗生素溶液（革蘭陽性菌選用青霉素和紅霉素，革蘭陰性菌選用慶大霉素和環丙沙星）以MH肉湯倍比稀釋成8個質量濃度，即4 MIC、2 MIC、1 MIC、1/2MIC、1/4 MIC、1/8MIC、1/16 MIC、1/32MIC。聯合藥物孔將不同質量濃度的水飛薊賓藥液與抗生素溶液兩兩組合加入96孔板，每種藥液每孔各加50μL；抗生素或水飛薊賓單藥孔加相應單一藥液每孔100μL；細菌生長陽性對照每孔加無菌MH肉湯100μL。再向每孔加入100μL菌懸液，振搖混勻后37℃培養18～24 h。記錄抗生素單用MIC（MIC甲藥單用）、水飛薊賓單用（MIC乙藥單用）和抗生素與水飛薊賓聯合應用MIC（MIC甲藥聯用和MIC乙藥聯用）。計算聯合抑菌指數（fractional inhibitory concentration，FIC）＝MIC甲藥聯用/MIC甲藥單用＋MIC乙藥聯用/MIC乙藥單用。實驗重復3次，取平均值。聯合抑菌效應判定：FIC≤0.5，2種藥物有協同作用；0.5＜FIC≤1，2種藥物有相加作用；1＜FIC≤2，2種藥物為無關作用；FIC＞2，2種藥物有拮抗作用。
2.7數據統計學分析
統計學處理采用SPSS 23.0統計軟件，計數資料以百分比表示。菌種間MIC值分布的總體比較采用Kruskal-WallisH秩和檢驗，兩兩比較采用單因素方差分析。FIC值分布的比較采用獨立樣本χ2檢驗，兩兩比較采用χ2分割法。