土霉素菌渣無害化處理：篩選菌株的生長曲線及產(chǎn)蛋白酶條件（一）
2.5.2培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶能力的影響
向100 mL/250 mL察氏培養(yǎng)基中，分別接入1 mL M-1、M-2孢子懸液，pH值為6.5，培養(yǎng)溫度分別設(shè)置為25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，平行3組。在轉(zhuǎn)速為160 r/min條件下培養(yǎng)168 h，分別取樣，測定酶活，考察溫度的變化對(duì)產(chǎn)酶活性的影響，結(jié)果如圖6。
圖6培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響
在30℃以下培養(yǎng)時(shí)，菌株M-1和M-2產(chǎn)生蛋白酶活力隨著溫度的升高而增大，溫度達(dá)到30℃時(shí)，它們酶活力均達(dá)到最高，而后隨溫度的提高酶活力下降。因此，菌株M-1和M-2產(chǎn)蛋白酶的最適溫度確定為30℃。
2.5.3培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響
分別向100 mL/250 mL察氏培養(yǎng)基中接入1 mL M-1孢子懸液、1 mL M-2孢子懸液，pH值為6.5，平行3組。在30℃轉(zhuǎn)速為160 r/min條件下培養(yǎng)192 h。每隔24 h分別取樣測定酶活，考察培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶活性的影響，結(jié)果如圖7。
圖7培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響
培養(yǎng)到48 h時(shí)，菌株M-1、M-2均開始產(chǎn)蛋白酶，培養(yǎng)至72 h時(shí)，酶積累量開始增大。在168 h時(shí)M-1產(chǎn)酶活力達(dá)到最高值，而M-2在144 h時(shí)酶活達(dá)到最高；在最高點(diǎn)之后，兩種菌的產(chǎn)酶活性隨之緩慢下降。因此，菌株M-1和M-2產(chǎn)蛋白酶的最適培養(yǎng)時(shí)間分別確定為168 h和144 h。
2.5.4菌渣添加量對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶能力的影響
分別在100 mL/250 mL蒸餾水中加入5、10、15、20、25 g的400目土霉素菌渣粉末，分別向其中接入1 mL M-1、M-2孢子懸液，平行3組。在pH 6.5，轉(zhuǎn)速為160 r/min，30℃條件下培養(yǎng)144 h，分別測定酶活，考察菌渣添加量對(duì)產(chǎn)酶活性的影響，結(jié)果如圖8。
圖8菌渣添加量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響
菌渣添加量為5%～10%，M-1產(chǎn)蛋白酶的活力隨菌渣添加量的增大而增加，10%達(dá)到最高。M-2產(chǎn)蛋白酶活力在5%時(shí)達(dá)到最高，在10%時(shí)也保持了較高的酶活力。隨后，兩種菌的酶活力隨著菌渣添加量的增大而快速下降。在菌株M-1和M-2產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)基中添加過多菌渣不利于其產(chǎn)生蛋白酶，這可能是菌渣中的一些成分影響了菌的產(chǎn)酶活性。所以，菌株M-1和M-2在菌渣培養(yǎng)基產(chǎn)蛋白酶的最適菌渣添加量分別確定為10%和5%。
2.5.5接種量對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶能力的影響
在100 mL/250 mL 5%的菌渣培養(yǎng)基中，分別接種1、3、5、7和9 mL的M-1、M-2孢子懸液，平行3組。在pH 6.5，轉(zhuǎn)速為160 r/min，30℃條件下培養(yǎng)144 h，分別取樣測定酶活，考察接種量對(duì)產(chǎn)酶活性的影響，結(jié)果如圖9。
圖9接種量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響
菌株M-1的產(chǎn)蛋白酶活力隨接種量的提高而增加，直至接種量為5 mL時(shí)其酶活力達(dá)到最高值，隨后其產(chǎn)酶活力逐漸下降，這可能是因?yàn)樵黾映跏季w的量導(dǎo)致菌體生長加快、發(fā)酵周期縮短。菌株M-2開始時(shí)，隨著接種量的加大其蛋白酶活力逐漸增加。所以，菌株M-1和M-2在菌渣培養(yǎng)基中產(chǎn)蛋白酶的最適接種量分別確定為5%和9%。
2.5.6裝液量對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶能力的影響
在250 mL的錐形瓶中分別加入5%的菌渣培養(yǎng)基20、40、60、80和100 mL，分別按照5%和9%的接種量接入M-1、M-2的孢子懸液，平行3組。在pH 6.5，轉(zhuǎn)速為160 r/min，30℃條件下培養(yǎng)144 h，分別取樣測定酶活，考察裝液量對(duì)產(chǎn)酶活性的影響，結(jié)果如圖10。
圖10裝液量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響
菌株M-1在裝液量低于40 mL時(shí)，其產(chǎn)生蛋白酶活力隨裝液量的加大而增加，在裝液量為40 mL時(shí)酶活達(dá)到最高，而后其酶活下降。菌株M-2的產(chǎn)蛋白酶活力隨著裝液量的增加而逐漸提高。所以，在250 mL錐形瓶中，M-1、M-2的最佳裝液量確定為40 mL和100 mL。
2.6菌株在優(yōu)化菌渣培養(yǎng)條件下的產(chǎn)蛋白酶活力測定
M-1的優(yōu)化培養(yǎng)條件：在250 mL錐形瓶中，40 mL裝液量，10%菌渣添加量，5%接種量，pH值6.0，30℃，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min培養(yǎng)168 h；M-2的優(yōu)化培養(yǎng)條件：在250 mL錐形瓶中，100 mL裝液量，5%菌渣添加量，9%接種量，pH值6.5，30℃，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min培養(yǎng)144 h。發(fā)酵結(jié)束后，測定蛋白酶活力。結(jié)果見表1。
表1篩選菌株產(chǎn)蛋白酶活力
在菌渣培養(yǎng)基中，菌株M-2在其最適產(chǎn)酶條件下，發(fā)酵上清液中蛋白酶活為44.41 u/mL，菌株M-1在其最適產(chǎn)酶條件下產(chǎn)蛋白酶活性達(dá)到99.33 u/mL，比菌株M-2的高出1.24倍。
2.7篩選菌株對(duì)土霉素菌渣的轉(zhuǎn)化
篩選菌株對(duì)菌渣成分的轉(zhuǎn)化研究中，共考察了菌渣總重量、蛋白成分的變化和發(fā)酵后游離氨基酸的變化等內(nèi)容，結(jié)果見表2。
表2菌渣活性成分的變化
菌株M-1和M-2在菌渣培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，對(duì)菌渣成分能夠有效轉(zhuǎn)化；其中M-1對(duì)總物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率達(dá)到6.21%，其中對(duì)菌渣蛋白質(zhì)成分轉(zhuǎn)化尤為明顯達(dá)到12.79%；菌渣經(jīng)M-1發(fā)酵處理后其游離氨基酸含量有明顯的提升，由原來7.14 mg增加到222.07 mg，提高了30倍。結(jié)果表明，篩選菌株M-1在簡單的菌渣培養(yǎng)基中能很好地生長，而且對(duì)菌渣蛋白質(zhì)有較好的水解和轉(zhuǎn)化活性。菌株M-2對(duì)菌渣總物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率達(dá)到2.4%，對(duì)菌渣蛋白質(zhì)成分轉(zhuǎn)化達(dá)到3.65%，菌渣經(jīng)M-2發(fā)酵處理后其游離氨基酸含量有較好的提升，由原來7.14 mg增加到49.26 mg，提高了6倍。經(jīng)M-1處理后的菌渣所減少的質(zhì)量大部分是蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)化所致，而M-2處理后的菌渣減少的質(zhì)量部分是轉(zhuǎn)化蛋白質(zhì)，另外一部分是被水解的其他物質(zhì)減少的量。
3結(jié)論
本實(shí)驗(yàn)篩選出兩株M-1、M-2，經(jīng)初步鑒定M-1為米曲霉菌，M-2為綠色木霉菌。M-1在pH 3、M-2在pH 6.5時(shí)生長量最大，均表現(xiàn)出良好的酸耐受性。兩株霉菌在土霉素濃度1 800 u/mL的條件下生長良好，具有較好的土霉素耐受性。菌渣pH值及土霉素殘留量對(duì)其生長沒有抑制作用，適合應(yīng)用于土霉素菌渣的處理，對(duì)堿性環(huán)境耐受性較差。兩株霉菌對(duì)處理菌渣是有效的，M-1的處理效果好于M-2。M-1對(duì)菌渣蛋白質(zhì)成分的轉(zhuǎn)化率達(dá)到12.79%，游離氨基酸含量提高了30倍；菌渣經(jīng)M-2發(fā)酵處理后其游離氨基酸含量提高了6倍。
篩選菌株可在酸性的菌渣環(huán)境中生長，可對(duì)生產(chǎn)菌渣進(jìn)行發(fā)酵處理，可以得到蛋白質(zhì)水解液，用水解液部分替代土霉素生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳、氮源進(jìn)行生產(chǎn)土霉素，可降低生產(chǎn)成本；同時(shí)達(dá)到菌渣的回收利用和無害化處理目的。對(duì)含大量抗生素殘留、成分復(fù)雜、難降解的危險(xiǎn)污染物菌渣，目前還缺乏高效、節(jié)能、環(huán)境友好型的處理方法。土霉素菌渣中的蛋白質(zhì)含量可達(dá)到43.88%，利用兩株霉菌生長及代謝的不同，如果實(shí)現(xiàn)兩種菌株的混合培養(yǎng)，作為互補(bǔ)進(jìn)而加強(qiáng)對(duì)菌渣的處理能力，對(duì)危險(xiǎn)菌渣的無害化處理及資源的再利用方面具有重大價(jià)值，這有待進(jìn)一步研究。
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