不同濃度的檸檬酸鈉對脫氮假單胞桿菌發酵過程的影響——結果與分析
2、結果與分析
2.1檸檬酸鈉對脫氮假單胞桿菌發酵過程基本參數的影響
不同濃度的檸檬酸鈉對菌體發酵過程基本參數的影響如圖1所示。其中A、B、C 3圖分別表示菌濃、pH以及維生素B12變化曲線。從圖中可以看出，發酵前72 h的菌體生長速度隨著檸檬酸鈉添加濃度的增大而明顯增加，這表明檸檬酸鈉的添加有助于P.denitrificans的菌體生長；另外，當發酵培養基中的檸檬酸鈉添加濃度為0.3%和0.4%時，其維生素B12發酵產量明顯高于未添加檸檬酸鈉的發酵處理，產量分別高達45.73μg/mL和50.44μg/mL，這表明檸檬酸鈉對產物合成具有一定的促進作用；進一步測定了發酵過程的pH變化情況，結果顯示檸檬酸鈉有助于維系發酵液的pH保持在合理水平，盡管0.3%和0.4%檸檬酸鈉添加方案下的菌體生長較為迅速，但是其整個發酵過程的pH卻一直穩定在6.5～7.0，而其他發酵方案的pH出現了明顯的下降趨勢。
綜合以上結果可以得出結論，發酵培養基中添加質量濃度為0.3%～0.4%的檸檬酸鈉不僅有利于P.denitrificans的菌體生長和維生素B12合成，而且還對發酵液的pH具有較強的緩沖作用，使得整個發酵過程的pH一值保持在較合理的水平。
圖1檸檬酸鈉脫氮假單胞桿菌發酵過程基本參數的影響
2.2檸檬酸鈉對有機酸代謝的影響
為了進一步研究檸檬酸鈉對脫氮假單胞桿菌代謝過程的影響，在發酵培養基中分別加入質量濃度為0%和0.3%的檸檬酸鈉，測定這2種發酵方案下有機酸動態變化情況。
由圖2可知在脫氮假單胞桿菌發酵過程中，檸檬酸、延胡索酸、琥珀酸和蘋果酸是主要的有機酸代謝物。檸檬酸鈉的添加明顯促進了發酵前期檸檬酸濃度積累。而隨著發酵的進行，這2種發酵處理的檸檬酸濃度均呈明顯的下降趨勢。然而，當培養基中未添加檸檬酸鈉時，其檸檬酸濃度反而顯著高于0.3%檸檬酸鈉添加量下的處理。這說明檸檬酸鈉的添加會抑制檸檬酸的生成。在發酵前中期添加檸檬酸鈉后，延胡索酸濃度升高，而發酵后期未添加檸檬酸鈉的發酵處理略高。因此，檸檬酸鈉的添加會促進延胡索酸的生成。但無論是否添加檸檬酸鈉，蘋果酸濃度在前36 h相差不大，但是此后未添加檸檬酸鈉的發酵過程的蘋果酸濃度則顯著高于0.3%檸檬酸鈉添加量的發酵處理，二者含量在72 h時相差達60 mmol/L。這說明檸檬酸鈉的添加會促進蘋果酸的消耗。在發酵前48 h，未添加檸檬酸鈉處理下的琥珀酸濃度明顯更高，在發酵后期這2種發酵處理的琥珀酸濃度相差不大。因此，檸檬酸鈉的添加會抑制琥珀酸的生成。
2.3檸檬酸鈉對糖代謝途徑中關鍵酶活力的影響
以不添加檸檬酸鈉的發酵處理為對照，考察了添加0.1%和0.3%2種質量濃度下菌體糖代謝途徑中關鍵酶的相對比酶活力。其結果如圖3所示，其中a、b、c、d和e圖分別表示葡萄糖激酶、丙酮酸激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、磷酸果糖激酶和檸檬酸合酶相對比活力。
圖2檸檬酸鈉對有機酸代謝的影響
圖3糖代謝途徑關鍵酶相對比活的時序變化
從圖3可以看出，在整個發酵過程中，添加了檸檬酸鈉后葡萄糖激酶的活力沒有明顯的變化，且添加與未添加檸檬酸鈉這兩者的酶活力相近，比值都在1上下略微波動，始終保持著較大的酶活力，說明檸檬酸鈉對葡萄糖激酶的影響不大。在整個發酵過程中，添加了檸檬酸鈉后丙酮酸激酶的活力變化很明顯。在發酵初期，添加檸檬酸鈉后丙酮酸激酶的活力較大，比未添加時增加了35%。隨著發酵的進行，其酶活力開始下降，且低于未添加檸檬酸鈉時的相對比活力，最低的僅有接近70%，同比發酵初期降低了接近60%。隨著葡萄糖的濃度增加，檸檬酸鈉開始降低丙酮酸激酶的活力，且較高濃度的檸檬酸鈉對丙酮酸激酶的抑制作用更強。
c為0.1%和0.3%2種檸檬酸鈉添加質量濃度下，其發酵過程中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的相對比酶活力時序變化。從圖中可看出，添加檸檬酸鈉后對葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活力有一定的影響，并從圖中可以看出，在菌體生長和維生素B12合成的開始階段，檸檬酸鈉提高了葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活力。從d圖不同時間相對酶活數據分析，添加檸檬酸鈉后明顯降低了磷酸果糖激酶的活性。除此之外，在整個發酵過程中，檸檬酸鈉濃度為0.3%的酶活力低于濃度為0.1%的處理，說明檸檬酸鈉對磷酸果糖激酶有強烈的抑制作用，且檸檬酸鈉的濃度越大，抑制作用越強。與磷酸果糖激酶的酶活力變化趨勢相類似，添加檸檬酸鈉的檸檬酸合成酶酶活力出現了明顯的下降，相對比活最大減少了70%。而且檸檬酸鈉的添加濃度越高，其檸檬酸合成酶酶活力越低。由此可見，檸檬酸鈉對檸檬酸合成酶的酶活力具有一定的抑制作用，這與前面添加檸檬酸鈉會抑制檸檬酸的生成相一致。
不同濃度的檸檬酸鈉對脫氮假單胞桿菌發酵過程的影響——摘要、結論與討論
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