鼠疫桿菌菌株在麥芽糖培養(yǎng)基環(huán)境下對(duì)應(yīng)的生長曲線圖
鼠疫或黑死病已造成2億多人死亡，鼠疫仍然是最具破壞性的細(xì)菌性流行病。鼠疫是由鼠疫耶爾森菌引起的人畜共患病主要通過跳蚤在哺乳動(dòng)物間傳播。鼠疫耶爾森菌屬于革蘭陰性小桿菌，物鞭毛，兼性厭氧，可在普通培養(yǎng)基中生長。黑死病的病原體是鼠疫耶爾森氏菌，通過一種稱為群體感應(yīng)的過程來感知自身產(chǎn)生的、分泌的化學(xué)信號(hào)。雖然與之密切相關(guān)的腸道致病菌假結(jié)核桿菌利用群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)，但群體感應(yīng)在鼠疫桿菌中的作用機(jī)制尚不清楚。在本論文研究中，研究人員對(duì)鼠疫桿菌進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄分析實(shí)驗(yàn)，以確定鼠疫桿菌群體感應(yīng)調(diào)節(jié)功能。
Bioscreen全自動(dòng)生長曲線分析儀的應(yīng)用
應(yīng)用全自動(dòng)生長曲線分析儀Bioscreen測(cè)試了鼠疫桿菌和鼠疫桿菌菌株突變體在麥芽糖培養(yǎng)基環(huán)境下對(duì)應(yīng)的生長曲線圖（OD600），對(duì)比了不同類型的鼠疫桿菌（突變體菌株和原始菌株）的生長情況，并計(jì)算了對(duì)應(yīng)的O600值上的差異。測(cè)試的生長曲線的周期為2天，培養(yǎng)過程中各菌株的搖晃、生長及OD值的測(cè)試全是自動(dòng)完成的，從而獲得AHLs對(duì)突變體鼠疫桿菌和常規(guī)鼠疫桿菌的生長情況的影響的相關(guān)數(shù)據(jù)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
在對(duì)鼠疫桿菌的研究中發(fā)現(xiàn)對(duì)基于?；劢z氨酸內(nèi)酯的群體感應(yīng)控制了鼠疫桿菌本身的幾種代謝功能的表達(dá)。利用酰基-同絲氨酸內(nèi)酯信號(hào)通路誘導(dǎo)麥芽糖發(fā)酵和乙醛酸旁路反應(yīng)。這種效應(yīng)在溫度為30度時(shí)被觀察到，這表明在低于正常哺乳動(dòng)物溫度的溫度下，鼠疫桿菌的群體感應(yīng)具有調(diào)節(jié)新陳代謝的潛在作用。從而鼠疫桿菌可以利用替代碳源促進(jìn)生長和/或在營養(yǎng)來源有限的自然生境中長期生存，有助于維持鼠疫桿菌的生存。
圖1、鼠疫桿菌群體感應(yīng)分子的鑒定。圖A表示的是R88 Y.鼠疫菌(實(shí)心圓)與R115 QS-Y.鼠疫菌(空心圓)生產(chǎn)的14C標(biāo)記AHL的HPLC分餾圖譜。圖B表示的是通過在指定的時(shí)間點(diǎn)將無細(xì)胞上清液添加到一株會(huì)對(duì)AI-2反應(yīng)為生物發(fā)光(RLU)的V.harveyii報(bào)告株中進(jìn)行監(jiān)測(cè)，監(jiān)測(cè)R88 Y.鼠疫桿菌(實(shí)心圓)和R115菌(空?qǐng)A)生長過程中產(chǎn)出AI-2和AHL的情況。圖C和圖D分布表示的是AI-2(C)和AHL(D)的生長情況。
圖2、Ahl的QS調(diào)節(jié)次生代謝。從指定菌株中分離RNA，按材料和方法采用qRT-PCR檢測(cè)mRNA水平。數(shù)據(jù)代表了每個(gè)突變體與R88品系之間轉(zhuǎn)錄差異的三倍測(cè)量平均值，R88品系的轉(zhuǎn)錄差異歸一化為每個(gè)樣本的16S rRNA，代表了至少三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。
圖3、AHLs上調(diào)麥芽糖操縱子的含量，促進(jìn)菌株在麥芽糖環(huán)境下的生長。(A)野生型菌株(WT)(黑色)和AHL突變體菌株的生長曲線圖(短橫線)，將鼠疫桿菌置于最小麥芽糖培養(yǎng)基(淺灰色虛線)中，在Bioscreen C全自動(dòng)生長曲線分析儀的微孔板中培養(yǎng)，并對(duì)其生長情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)。(B)AHL突變菌與pypeIR(黑色，虛線)或yspIR(灰色，虛線)可在麥芽糖上恢復(fù)生長，而控制質(zhì)粒(黑色，實(shí)心)則不能生長。
圖4、群體感應(yīng)調(diào)節(jié)糖的發(fā)酵。(A)在含有剛果紅和0.2%麥芽糖的LB平板上生長96小時(shí)后的菌落表型，并在指示溫度下孵育。鼠疫桿菌將麥芽糖發(fā)酵成酸，將剛果紅轉(zhuǎn)化為黑，而yspIR ypeIR突變體則不會(huì)。這種發(fā)酵不會(huì)發(fā)生在溫度超過30度或其他糖的條件下。（B）鼠疫桿菌在固體培養(yǎng)基上厭氧培養(yǎng)96 h，培養(yǎng)溫度為28度。剛果紅是一種指示劑染料，在生產(chǎn)發(fā)酵最終產(chǎn)品時(shí)變暗。R114和R115中yspIR和ypeIR的缺失導(dǎo)致了麥芽糖在厭氧條件下發(fā)酵的滯后。1=Y.假結(jié)核桿菌;2=R88;3=R502;4=R115
圖5、AHL群體感應(yīng)上調(diào)乙醛酸旁路并促進(jìn)醋酸鹽的生長。(A)將R88(黑色)和R115 AHL無突變鼠疫桿菌株(虛線)在最小醋酸鹽培養(yǎng)基(淺灰色僅為培養(yǎng)基對(duì)照)中生長，并應(yīng)用Bioscreen C全自動(dòng)生長曲線分析儀上的微孔板上監(jiān)測(cè)其菌株的深情況。（B）AHL突變菌與pypeIR(黑色虛線)或pyspIR(灰色虛線)可以在醋酸鹽環(huán)境中恢復(fù)生長，而對(duì)照質(zhì)粒(黑色固體實(shí)線)則不能。
總結(jié)
鼠疫桿菌是由一種由鼠疫耶爾森氏菌引起的人畜共患病主要通過跳蚤在哺乳動(dòng)物間傳播的疾病，而黑死病的病原體是鼠疫耶爾森氏菌，是通過一種稱為群體感應(yīng)的過程來感知自身產(chǎn)生的、分泌的化學(xué)信號(hào)。雖然與之密切相關(guān)的腸道致病菌假結(jié)核桿菌利用群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)，但群體感應(yīng)在鼠疫桿菌中的作用機(jī)制尚不清楚。研究人員對(duì)鼠疫桿菌的轉(zhuǎn)錄分析實(shí)驗(yàn)，以確定鼠疫桿菌群體感應(yīng)調(diào)節(jié)功能。為了獲得鼠疫桿菌群體感應(yīng)調(diào)節(jié)功能的相關(guān)機(jī)制，研究人員應(yīng)用了芬蘭Bioscreen C公司開發(fā)的全自動(dòng)生長曲線分析儀研究不同類型的鼠疫桿菌菌株（鼠疫桿菌菌株、不同類型的鼠疫桿菌突變體）在以麥芽糖培養(yǎng)基為碳源的基質(zhì)中生長情況，并且同步研究這些鼠疫桿菌在不同溫度下（30度，37度）的生長情況（OD600），獲得相關(guān)生長曲線分析圖。由于Bioscreen C全自動(dòng)生長曲線分析儀具有可以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同菌株培養(yǎng)過程中搖晃、生長及OD值的測(cè)試全部是自動(dòng)完成，而常規(guī)的酶標(biāo)法測(cè)試OD值需要一個(gè)一個(gè)的去測(cè)試，因此該設(shè)備的高通量方法也為研究人員節(jié)省大量時(shí)間，并提供了非?？煽康年P(guān)于進(jìn)行了鼠疫桿菌突變體和常規(guī)鼠疫桿菌的生長曲線數(shù)據(jù)圖，也為研究人員了解群體感應(yīng)在鼠疫桿菌中的作用機(jī)制提供了非常重要的數(shù)據(jù)，研究人員提出群體效應(yīng)（QS）對(duì)鼠疫桿菌在長期的營養(yǎng)限制期間對(duì)碳的利用是以一種可能最大化細(xì)菌生長和長期的方式在野外生存的機(jī)制，這說明全自動(dòng)生長曲線分析儀Bioscreen C為在研究鼠疫桿菌的相關(guān)研究方面具有很好的應(yīng)用前景。
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