丙酸鈣、山梨酸鉀對面包腐敗真菌的時間生長的功效
烘焙產品是中等水分食品（約0.95 a w；pH 5.0-6.0），因此如果不添加控制策略（例如食品級防腐劑、氣調包裝和儲存以及使用保濕劑。隨著消費者減少防腐劑使用的壓力，現在正在尋找替代的天然防腐劑。然而一些腐敗真菌已經進化為對現有使用的防腐劑更具耐受性。因此需要關于重要腐敗霉菌對此類發酵烘焙食品中使用的防腐劑的相對敏感性/抵抗力的更準確數據。大多數這些防腐劑被食品和藥物管理局(FDA)普遍認為是安全的(GRAS)，這通常意味著它們可以用于控制原材料和成品中的微生物污染（Garcia-Garcia和Searle，2016年）。然而，一些報告表明對這些防腐劑存在耐受性。例如，P.roqueforti菌株被發現對面包中使用的推薦濃度的丙酸鈣(CP；3,000 ppm)具有抗性，并且被發現在處理過的面包基質中生長。
用于細菌和酵母研究的Bioscreen C全自動微生物生長曲線分析系統也可以通過對液體肉湯培養基的細微修改用于絲狀菌生長測定。這使得能夠快速篩選新化合物的功效、產霉菌毒素腐敗真菌的生長生態和霉菌毒素產生，以及生物防治劑配方的比較。本研究的目的是檢查從明顯變質的面包中分離出的三種不同真菌菌株（H.burtonii(HB17)、P.variotii(PV10)和P.roqueforti(PR06)]）的相對敏感性/耐受性。使用Bioscreen C檢測系統測定一系列濃度(0–128 mM)CP和山梨酸鉀(PS)對其時間生長的功效。有助于比較這兩種防腐劑對(a)與溫度（25和30°C）、水分活度（a w,0.95,0.97)和pH(5.0,5.5)和(b)使用相對檢測時間(TTD)值來確定這三個物種中的哪一個可能對這兩種食品級防腐劑更敏感/更有彈性。
Bioscreen C全自動微生物生長曲線分析儀用于量化不同濃度的防腐劑對微生物隨時間生長的功效。在100孔微量滴定板中裝入200μl具有防腐處理條件（pH;a w）的半固體YES培養基，并用每種菌株的孢子懸浮液接種。使用600 nm波長每20分鐘記錄一次光密度(OD)的時間變化，持續6天（8,640分鐘），因為它與真菌生物量的變化直接相關，獲得相關微生物的生長曲線。實驗分別是在25°C和30°C下進行，每個處理重復5次，實驗重復一次。
實驗結果：利用快速濁度法測定系統(Bioscreen C)來檢查丙酸鈣(CP)和山梨酸鉀(PS)控制重要面包腐敗真菌生長的時間效力。目的是比較三種重要的腐敗真菌Hyphophichia burtonii(HB17)、Paecilomyces variotii(PV11)和Penicillium roqueforti的菌株的時間增長(PR06)從明顯模制的面包中分離到(a)不同濃度的CP和PS(0–128 mM)，(b)溫度(25°C,30°C)，(c)水分活度（a w；0.95，0.97)和(d)pH(5.0,5.5)。所有三個非生物因素，pH、a w和溫度以及防腐劑濃度都會影響所檢查物種的相對生長。總的來說，PS在抑制這三個物種的菌株生長方面比CP更有效。此外，還比較了在相互作用的非生物因素下防腐劑功效的檢測時間(TTD)。Paecilomyces variotii(PV10)菌株對防腐劑的耐受性最強，兩種防腐劑的TTD值都最短。P.roqueforti在所有檢查的條件下，是最敏感的，具有最長的TTD值。
圖1、在含有不同濃度的丙酸鈣(CP)和(C,D)山梨酸鉀(PS)的情況下，擬青霉菌(PV10)在(A,B)和山梨酸鉀(PS)的半固體酵母提取物蔗糖(YES)培養基中的生長曲線（0–128 mM)使用BioScreen(C)培養超過6天。每條曲線代表五次重復的平均值。
圖2、在(A)25°C和(B)30°C下，CP對Hyphophichia burtonii(HB17)生長（8,640分鐘，6天）的影響。PS對生長的影響分別顯示在(C)25°C和(D)30°C中。從圖中顯示了CP和PS在6天后對H.burtonii生長的相對抑制作用。PS在控制(p<0.05)H.burtonii(HB17)生長方面具有顯著的效果。對于CP，在25°C/pH 5.0和0.97 a w下，與相同濃度的其他處理相比，這種腐敗酵母更具彈性并且能夠有效生長。6天后，測試的最高濃度在0.95 a w（OD 0.83和0.86，p<0.05）和25°C下具有良好的功效。對于PS，在25°C和30°C觀察到顯著的(p<0.05)抑制作用，在0.95 a w中檢測到的最高濃度（64和128 mM）處理（見圖1C、D）。在30°C時，有效抑制需要最高濃度(128 mM)。
圖3、HB17在(A)25°C和(B)在不同濃度CP存在下的檢測時間（TTD；OD=0.4 OD；6天）；對于PS在(C)25°C和(D)30°C。在25°C存在CP的情況下，H.burtonii(HB17)的TTD周期最長。在0.97 a w處理中，在4和16 mM濃度下，這些時間>5.0天（圖3A）。在30°C下，最長TTD值（p<0.05）在0.95 a w處獲得（圖3B）。對于PS，需要測試的最高防腐劑濃度(128 mM)才能有效控制30°C的生長。
圖4、P.variotii(PV10)在(A)25°C和(B)在30°C在不同濃度的CP存在下的TTD（OD=0.4 OD；6天）；對于PS在(C)25°C和(D)30°C。P.variotii(PV10)菌株在25°C下耐受所有CP濃度。事實上，在30°C時，增加CP的濃度似乎會刺激生長（圖4A、B）。然而，該菌株無法在pH 5.0和>32 mM PS下開始生長（p<0.05）。對于P.variotii，將溫度提高到30°C會導致PS更好的抑制，主要是在pH 5.0時，在實驗時間范圍內（6天；圖4C、D）沒有開始生長。
圖5、在(A)25°C和(B)在不同濃度的CP存在下，Penicillium roqueforti(PR06)的TTD-監測時間）（OD=0.4 OD；6天）；對于PS在(C)25°C和(D)30°C。無論是否存在防腐劑，尤其是在檢查較高pH值時，P.roqueforti(PR06)菌株顯示了最長TTD周期。
總結：面包的真菌腐敗是食品工業中一個持續存在的問題，需要使用防腐劑來在環境儲存條件下為此類產品獲得必要的保質期。本論文研究直接從生產設施中的變質面包中分離出這些菌株，在分離的不同真菌物種中，普遍發現了H.burtonii，因為已知它是造成面包“發霉”缺陷的原因。P.variotii和P.roqueforti也經常在衛生條件差的面包店生產工廠中發現。這是第一次使用Bioscreen C快速生物測定系統詳細研究面包/烘焙產品生產過程中常用防腐劑的效果以及防腐劑對控制此類腐敗真菌的可能不同影響。本研究表明，使用該系統可以獲得一致且可重復的結果，以比較這兩種常用防腐劑在不同相互作用的非生物條件下模擬發酵面包產品中的條件/防腐劑對生長的相對控制的功效。總的來說，PS在控制H.burtonii和P.variotii的生長方面比CP更有效，但對P.roqueforti尚不清楚.此外應用Bioscreen C全自動生長曲線分析儀這可能是一種有價值的快速替代工具，可用于挑戰測試以檢查使用不同防腐劑時新配方烘焙產品的保質期。