不同光照、pH條件對血紅密孔菌培養過程中生物量、總抗氧化能力的影響（一）
藥用真菌是很重要的中藥來源之一，具有降血脂、抗腫瘤、改善機體免疫力等多種功效。真菌能夠在其生長過程中產生大量的生理活性物質，主要包含黃酮、多酚、多糖、有機酸、甾體、萜類與多肽等，具有很好的抗腫瘤、抗氧化等活性，且毒副作用較低。紅平菇多糖能夠通過增強抗氧化酶活性、清除肝臟中釋放的自由基阻斷氧化鏈反應來緩解由四氯化碳誘導的急性肝損傷，保護肝臟；研究發現香菇菌絲體多糖可通過提高機體抗氧化能力來緩解由苯酚誘導的大鼠口腔潰瘍，減輕其炎性反應。研究發現，銀耳多糖可通過降低血小板數目，減少黏附率，起到抗血栓的作用。靈芝三萜化合物能夠通過激活ERK和JNK促分裂原激活蛋白激酶，促使肝癌細胞HuH-7凋亡。血紅密孔菌(Pycnoporussanguineus)是擔子菌綱、多孔菌科、密孔菌屬的一種白腐真菌。具有殺滅細菌、抑制腫瘤、消炎止血等作用。研究發現血紅密孔菌的次級代謝產物色素具有抑制革蘭陽性菌的作用；當液態培養血紅密孔菌色素質量濃度為4.32μg/mL時，抑菌率高達98%。密孔菌可作為食品應用于保健品的開發，也可用于治療皮膚損傷。目前對血紅密孔菌的研究多集中在木質纖維素類原料生物轉化方面，而培養條件(光照和pH)對血紅密孔菌生長及抗氧化活性影響的研究并不多見。不同的培養條件尤其是光照和pH，對真菌生長，抗氧化能力都有較大影響。連續兩周的光照條件及pH 9時對真菌多酚含量的影響較大，抗氧化能力達到最高，約為其他條件的1.2倍和1.5倍。24 h光照條件下，忍冬纖孔菌生物量較低，但DPPH自由基的清除能力相對較高，約為其他條件的0.6倍和1.2倍；在初始培養液pH分別為5及3條件下，菌絲體生物量和提取物活性均達到最高，最高可達其他條件的1.5倍和3倍；光照條件下樺褐孔菌生物量比黑暗中的低，而DPPH自由基清除活性則比黑暗條件下高。生物抗氧化能力主要是清除自由基，目前自由基清除能力分析的常用方法是DPPH法，該法也是評價物質體外抗氧化活性的重要方法。本研究通過對血紅密孔菌的培養，對不同光照和pH條件下血紅密孔菌的生物量、DPPH自由基清除能力和總抗氧化能力進行分析，為進一步優化血紅密孔菌培養條件提供參考，也支持了進一步探究其藥理藥效。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1菌種來源血紅密孔菌(Pycnoporussanguineus)，購自中國農業微生物菌種保藏管理中心(ACCC 51180)。
1.1.2培養基(g/L)①固體PDA培養基：馬鈴薯200，葡萄糖20，KH2PO41.5，MgSO4·7H2O 1,瓊脂20,水1 000 mL，pH自然。②液體PDA培養基：馬鈴薯200，葡萄糖20，KH2PO41.5，MgSO4·7H2O 1,水1 000 mL，pH根據實驗需要調節。
1.2方法
1.2.1菌種活化與培養菌種接種于固體PDA培養基上，28℃培養7 d后轉接到液體PDA培養基中搖床培養，28℃、150 r/min培養7 d，取出留作后續實驗使用。
1.2.2不同光照與pH條件培養①光照對血紅密孔菌的影響：用滅菌后的勻漿器打碎活化后的菌體發酵液，經充分振蕩后以2%的接種量接種到250 mL錐形瓶中(含有100 mL液體PDA培養基，pH自然)，設置14 d黑暗(D)、14 d光照(L)和1 d黑暗、1 d光照(DL)交替3種光照條件，設3個平行，每2 d取樣，于恒溫搖床28℃、150 r/min培養。②pH對血紅密孔菌的影響：用滅菌后的勻漿器打碎活化后的菌體液，經充分振蕩后以2%的接種量接種到100 mL液體PDA培養基(已分別調節pH至3.0、5.0、7.0、9.0)，28℃、150 r/min黑暗條件下培養14 d，設3個平行，每隔2 d取樣檢測。
1.2.3菌體及上清收集每2 d取樣，8 000 r/min離心15 min；收集菌體60℃烘干至恒重，稱量記錄不同培養條件下菌體生物量，生物量(g/L)=菌絲體干重(g)/發酵液體積(L)；收集上清液用于DPPH自由基清除能力檢測、胞外T-AOC含量檢測。
1.2.4總抗氧化能力檢測采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。待測樣品分為測定管與對照管，測定管中依次加入相關試劑及待測樣品；對照管中除不加入待測樣品外，其余同測定管一致。37℃充分反應30 min后，各加入顯色劑(對照管中另加入待測樣品)分別充分混勻；于520 nm波長下，測定各管吸光度值。總抗氧化能力計算公式：
總抗氧化能力(U/mL)=
1.2.5 DPPH自由基清除能力檢測收集不同培養條件下的上清各100μL于96孔板中，并向每孔中加入100μL 2.0×10-4mol/L的DPPH溶液，混勻后室溫避光放置30 min，于517 nm波長處檢測各孔的吸光值，清除率計算公式：
清除率(%)=(1-(Ai-Aj)/A0)×100%
式中：Ai為DPPH溶液與樣品混合后溶液的吸光值；Aj為樣品溶液的吸光值；A0為DPPH溶液的吸光值。
1.2.6統計學分析所得的結果數值均以平均值及標準差表示，數據用SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析，P<0.05時為差異顯著。
2結果與分析
2.1不同光照及pH條件對血紅密孔菌生長過程中生物量變化的影響
2.1.1光照不同光照培養條件下，血紅密孔菌生物量均基本呈上升趨勢(圖1)。14 d光照條件下，生物量先上升至第8天為2.68 g/L，于第10天有所下降，后又升至2.92 g/L(第12天)，后于第14天略降至2.28 g/L;1 d光照1 d黑暗交替條件下，生物量于第2～12天略有升高，并在第14天最終達到2.94 g/L;14 d黑暗條件下，第2～10天血紅密孔菌的生物量處于緩慢上升狀態，并于第10天～12天生物量大幅上升，隨后緩慢上升并于第14天達到最大值，為4.49 g/L。綜上所述，14 d黑暗條件更利于血紅密孔菌的生長，于第10～14天生長過程中，其生物量均明顯高于14 d光照組及14 d光照黑暗交替組且差異顯著。
圖1不同光照條件對血紅密孔菌生物量的影響
2.1.2 pH值在血紅密孔菌的生長過程中，不同pH條件對其生物量的影響較大(圖2)。當pH為3時，生物量于第4天達到最大值4.89 g/L，后續保持基本平穩狀態；當pH為5時，生物量一直上升至第10天，達最大值7.12 g/L，隨后略有下降，第14天下降至6.49 g/L；當pH為7時，生物量從第2～4天保持平穩，從第4～12天處于上升狀態，于第12天達最大值5.70 g/L，隨后有所下降，降至5.48 g/L；當pH為9時，生物量從第2～14天基本保持升高，并于第14天達最大值6.19 g/L。綜上所述，pH為5時，血紅密孔菌的生物量增長最大且后期(第8～14天)較其余3組增長明顯。因此，pH 5更適于該菌的生長。
圖2不同pH條件對血紅密孔菌培養過程中生物量的影響
不同光照、pH條件對血紅密孔菌培養過程中生物量、總抗氧化能力的影響（一）
不同光照、pH條件對血紅密孔菌培養過程中生物量、總抗氧化能力的影響（二）
相關新聞推薦
1、?嗜黏蛋白阿克曼菌在硫乙醇酸鹽液體培養基中的生長情況與代謝產物（一）
2、不同濃度的檸檬酸鈉對脫氮假單胞桿菌發酵過程的影響——材料與方法