焦化污染場(chǎng)地中萘降解菌株AO-4鑒定、生長(zhǎng)、降解機(jī)理及環(huán)境條件帶來(lái)的影響（二）
1材料和方法
1.1實(shí)驗(yàn)材料及儀器
1.1.1土壤樣品的采集
供試土壤采集于山西省某煤焦化工污染場(chǎng)地，隨機(jī)采集多個(gè)取樣點(diǎn)的表層（0～10cm）土壤，將采集到的土壤樣品用2mm土壤篩進(jìn)行篩分，剔除雜質(zhì)。充分混勻后，于4℃冰箱中保存。
1.1.2化學(xué)試劑
本研究所使用的主要藥品：萘、芴、菲等PAHs（純度大于97%，美國(guó)Aladdin公司）；甲醇、乙酸乙酯等有機(jī)試劑（色譜純，美國(guó)Fisher Chemical公司）；蛋白胨等非有機(jī)試劑（分析純，上海生工生物工程公司化學(xué)試劑）。
1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器
BCV-1FD超凈工作臺(tái)（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、LRH生化培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）、Agilent 1260型高效液相色譜儀（安捷倫科技（中國(guó)）有限公司）、THZ-C恒溫振蕩培養(yǎng)箱（蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、LS-50H立式壓力蒸汽滅菌鍋（江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司）、UV8000S紫外分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）、KH20R高速冷凍離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）、Nikon YS100生物顯微鏡[奧林巴斯（中國(guó)）有限公司]、SC850全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)（上海山富科學(xué)儀器有限公司）、veriti96 PCR儀（賽默飛世爾科技有限公司）。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1試劑配置
實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基包括LB培養(yǎng)基和MSM無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，配方如下。
LB養(yǎng)基：蛋白胨10.00g/L，酵母膏10.00g/L，NaCl 5.00g/L，pH=7.2。
MSM無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：K2HPO4·3H2O 4.25g/L，NaH2PO4·H2O 1.00g/L，NH4Cl 2.00g/L，MgSO4·7H2O 0.20g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.012g/L，MnSO4·H2O 0.003g/L，ZnSO4·7H2O 0.003g/L，CoSO4·7H2O 0.001g/L，pH=7.0～7.2。
配置時(shí)按以上濃度稱量，用蒸餾水定容至1000mL，固體培養(yǎng)基配方在此基礎(chǔ)上加15g/L瓊脂，在121℃、0.103MPa條件下滅菌20min。
PAHs的配置：用丙酮作為溶劑配制萘（濃度為100g/L）、芴、菲、蒽、芘（濃度分別為5g/L）的溶液，通過(guò)無(wú)菌有機(jī)濾頭（孔徑0.22μm）過(guò)濾除菌，按所需濃度添加到降解體系中后，待丙酮揮發(fā)完畢使用。
1.2.2萘降解菌的篩選
取10g污染土壤加入到90mL無(wú)菌水中，于溫度30℃、轉(zhuǎn)速130r/min條件下浸取5h，靜置30min后，取5mL上清液加入到45mL以萘（100mg/L）為唯一碳源的萘選擇性液體MSM培養(yǎng)基中，在30℃、130r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)7d，然后再次轉(zhuǎn)接到新鮮的萘（150mg/L）選擇性液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，如此重復(fù)。經(jīng)7個(gè)周期馴化培養(yǎng)，逐步將萘的濃度提升至400mg/L后，取適量富集培養(yǎng)液，梯度稀釋后涂布在含萘（400mg/L）的選擇性固體培養(yǎng)基平板上，置于30℃生化培養(yǎng)箱中；待菌落長(zhǎng)出后，挑取菌落大小及形態(tài)顯著的單個(gè)菌落在含萘選擇性固體培養(yǎng)基上進(jìn)一步純化，直至得到形態(tài)單一的純菌種。
1.2.3萘降解菌的鑒定
1.2.3.1革蘭氏染色鑒定
取少量活化后的菌液，滴加在干凈的載玻片上干燥固定后，滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液染色2min，立即傾去染料，用細(xì)流蒸餾水沖洗直到流水為無(wú)色。再在涂菌區(qū)域滴加適量的革蘭氏碘液，作用1min后傾去多余的碘液，最后用水流沖至流出液為無(wú)色。用吸水紙吸去載玻片上多余的水分，滴加體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇脫色30s左右至流出液為無(wú)色，接著用蒸餾水沖去乙醇后吸干，番紅復(fù)染3min，水洗并使之干燥。在顯微鏡下用100倍油鏡觀察經(jīng)染色的菌落顏色。
1.2.3.2 16S rDNA擴(kuò)增及測(cè)序鑒定
將純化的單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，取新鮮菌液用細(xì)菌基因組提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取基因組DNA。用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)擴(kuò)增其16S rDNA基因序列。PCR體系為：Super Mix 20μL、ddH2O 12μL、通用引物27F(10μmol/L)1μL、通用引物1492R(10μmol/L)1μL、模板DNA 6μL。擴(kuò)增條件為：94℃、30s，55℃、30s，72℃、90s，35個(gè)循環(huán)。將PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列同源性比對(duì)，用MEGA 7.0進(jìn)行同源性分析，依據(jù)鄰接法（neighbor joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定萘降解菌AO-4的種屬。
1.2.4萘降解途徑中的部分關(guān)鍵酶基因的PCR擴(kuò)增
選取萘降解途徑中的關(guān)鍵酶萘雙加氧酶的鐵硫蛋白大亞基基因nahAC、水楊醛脫氫酶基因nahF、水楊酸羥化酶基因nahG及鄰苯二酚2，3-雙加氧酶基因nahH進(jìn)行PCR擴(kuò)增與鑒定。引物序列如下。
1.2.5萘降解菌對(duì)PAHs（萘、芴、菲、蒽、芘）的降解體系
將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AO-4菌液（OD600=1）按一定體積接種至含特定濃度的萘、芴、菲、蒽、芘MSM培養(yǎng)基中，于溫度30℃、轉(zhuǎn)速130r/min條件下?lián)u床避光培養(yǎng)，定時(shí)取樣，按需測(cè)定菌體濃度OD600、培養(yǎng)液中PAHs含量及菌體脫氫酶活性，實(shí)驗(yàn)設(shè)置三組平行試樣，并設(shè)置無(wú)菌組作為空白對(duì)照。
1.2.6環(huán)境單因素對(duì)萘降解的影響
本研究以降解率作為考察指標(biāo)，研究環(huán)境因素包括溫度、pH、萘初始濃度和菌種接種量對(duì)萘降解的影響，培養(yǎng)條件均在30℃、130r/min的搖床避光培養(yǎng)。
設(shè)置體系的不同溫度分別為10℃、20℃、30℃、40℃，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液按2%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接種至含有20mg/L萘的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（pH=7.0）中，定時(shí)取樣測(cè)定不同溫度下菌株AO-4對(duì)萘的降解率。
調(diào)整體系的初始pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液按2%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量接種至含有20mg/L萘的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，定時(shí)取樣測(cè)定不同初始pH下菌株AO-4對(duì)萘的降解率。
選取小于萘在水中溶解度的濃度（1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L），將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液按2%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種至含有以上濃度的萘的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（pH=7.0）中，定時(shí)取樣測(cè)定菌株AO-4對(duì)不同濃度的萘的降解率。
將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液分別按0、1%、2%、5%的接種量（體積分?jǐn)?shù)）接種至含有20mg/L萘的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（pH=7.0）中，定時(shí)取樣測(cè)定不同接種量下菌株AO-4對(duì)萘的降解率。
1.2.7 PAHs濃度的測(cè)定及降解率計(jì)算
試樣用等體積的乙酸乙酯萃取，在振蕩器上通過(guò)1500r/min轉(zhuǎn)速振蕩5min后超聲萃取10min，再經(jīng)10000r/min轉(zhuǎn)速離心5min后可分離有機(jī)相和水相，用0.22μm孔徑的有機(jī)濾膜過(guò)濾乙酸乙酯萃取液后，利用高效液相色譜儀（HPLC）測(cè)定各PAHs的濃度，HPLC測(cè)試條件：ZORBAX Eclipse PAHs色譜柱，紫外檢測(cè)器，柱溫30℃，流動(dòng)相為甲醇和水，流速1mL/min，進(jìn)樣量20μL，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm。
降解率η的計(jì)算依據(jù)式(1)。
式中，C0為PAHs的初始濃度，mg/L；Ct為反應(yīng)t時(shí)間后PAHs的濃度，mg/L。
1.2.8脫氫酶活性的測(cè)定
通過(guò)測(cè)定微生物的脫氫酶活性可以了解微生物對(duì)有機(jī)污染物的氧化分解能力，按照文獻(xiàn)方法：在具塞試管中，加入降解后的培養(yǎng)液、Tris-HCl緩沖溶液（pH=8.5、0.05mol/L）、葡萄糖溶液（0.10mol/L）、TTC（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%）各2mL，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中避光反應(yīng)。反應(yīng)4h后，加入400μL濃硫酸中止反應(yīng)，并加入5mL甲苯，1500r/min振蕩10min進(jìn)行萃取。待反應(yīng)生成的紅色三苯基甲臜（TF）被完全萃取到有機(jī)相時(shí)，將有機(jī)相在4000r/min下離心5min，過(guò)濾后測(cè)定濾液于486nm處的吸光度（OD486），以此表征萘降解菌的脫氫酶活性。
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