鼠疫耶爾森氏菌在3種選擇培養(yǎng)基生長能力的測定——材料與方法
在鼠疫疫源地監(jiān)測中，當(dāng)動物鼠疫處于流行末期或靜息期，由于鼠疫菌毒力減弱或完全喪失，不能致動物死亡，但存在于動物體內(nèi)，由于菌量減少，若按一般常規(guī)培養(yǎng)基分離鼠疫菌比較困難，因此進(jìn)行培養(yǎng)時必須要求特別敏感的增菌培養(yǎng)基分離鼠疫菌，而且自然界鼠疫菌一般從自斃動物體內(nèi)分離，由于自斃動物腐敗，從一個污染的材料中分離鼠疫耶爾森菌(鼠疫菌)，受變形桿菌、革蘭氏陽性菌的影響鼠疫菌分離困難[1]。因此研制及應(yīng)用一種分離鼠疫耶爾森氏菌的選擇培養(yǎng)基，可以提高鼠疫菌的分離率，是野外鼠疫監(jiān)測現(xiàn)場及實驗室研究的關(guān)鍵技術(shù)。現(xiàn)有鼠疫菌的選擇培養(yǎng)基主要有龍膽紫培養(yǎng)基，在實際工作中，這2種培養(yǎng)基分離污染材料中的鼠疫菌效果不理想，本研究根據(jù)鼠疫菌培養(yǎng)特性，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入可以刺激鼠疫菌生長的生化試劑和抑制變形桿菌及革蘭氏陽性菌的試劑，研制出2種選擇敏感培養(yǎng)基(1%枸椽酸鈉選擇培養(yǎng)基和4%十二烷基硫酸鈉選擇培養(yǎng)基)，通過實驗菌株在以上2種培養(yǎng)基的生長測試，并收集野外材料現(xiàn)場分離，比較2種選擇敏感培養(yǎng)基對于鼠疫菌的檢出性能和檢測效果，初步評價其應(yīng)用效果。
1、材料與方法
1.1材料
1.1.1腐敗材料搜集野外動物材料(旱獺，犬)共5份，其中1號和4號旱獺僅剩股骨殘骸，2號、3號旱獺及5號犬臟器高度腐敗，但仍保留心、肝、脾、肺，各臟器均有不同程度潰爛。
1.1.2實驗菌株
耶爾森氏菌屬的鼠疫疫苗株(EV菌株)、假結(jié)核耶爾森菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌以及野外腐敗材料常見雜菌:變形桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、A群鏈球菌均由鼠疫菌專業(yè)實驗室提供。
1.1.3儀器設(shè)備
丹麥Biosense微生物全自動菌落計數(shù)器，英國Symbioses公司;低氧細(xì)胞工作站H45 HEPA，英國DWS公司;Ⅱ級B2型生物安全柜，賀利氏HERAsafe生物，德國Heraus公司，中國細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)管(批號2018-1)由中國藥品生物制品檢定所提供。
1.2方法
1.2.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備
赫氏瓊脂，含牛肉消化液200 m L，水800 m L，蛋白胨10 g，瓊脂14 g，乳糖10 g，調(diào)p H7.2～p H7.4。對照培養(yǎng)基:1%溶血赫氏培養(yǎng)基，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基121℃高壓滅菌30 min后冷卻至50℃左右，冷卻后加入10%脫纖維兔溶血，混勻后傾注平皿。
1.2.2龍膽紫培養(yǎng)基
龍膽紫0.1 g加無水乙醇2 m L溶解后，加蒸餾水至90 m L，121℃高壓滅菌30 min高壓滅菌后冷卻至50℃加入新鮮血液10 m L，混合后取10 m L加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基1 L，制備成含有1/10萬龍膽紫溶血瓊脂培養(yǎng)基。
1.2.3 1號培養(yǎng)基
(4%十二烷基硫酸鈉選擇培養(yǎng)基)十二烷基硫酸鈉4 g，紅霉素0.5 mg，膽鹽3號5 g，阿莫西林12.5 mg，甘露醇1 g，中性紅0.03 g)。2號培養(yǎng)基(1%枸櫞酸鈉選擇培養(yǎng)基)去氧膽酸鈉1 g，枸櫞酸鈉1 g，枸櫞酸鐵1 g。將以上2種選擇培養(yǎng)基試劑分別經(jīng)121℃高壓滅菌30 min后冷卻至50℃的1000 m L基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，即組成不同的選擇培養(yǎng)基，4℃保存?zhèn)溆谩?
1.2.4鼠疫耶爾森氏菌在3種選擇培養(yǎng)基生長能力的測定
將鼠疫EV菌株28℃培養(yǎng)48 h，制成濃度為1000個菌/m L菌懸液，取0.1 m L分別接種以上3種選擇培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基，置于28℃溫箱培養(yǎng)24～48 h，實驗重復(fù)3次，觀察記錄平板單個菌落生長情況。
1.2.5 3種培養(yǎng)基敏感性及特異性檢測
將各實驗菌株(耶爾森氏菌屬的鼠疫EV菌株、假結(jié)核耶爾森菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌)、野外腐敗材料常見雜菌(變形桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、A群鏈球菌)制成菌懸液，根據(jù)比濁管稀釋成1000個菌/m L菌懸液，取0.1 m L涂布到4種培養(yǎng)基上，實驗重復(fù)3次，28℃孵箱培養(yǎng)24～48 h，觀察細(xì)菌生長情況。
1.2.6腐敗動物材料
鼠疫菌分離培養(yǎng)采集腐敗動物臟器材料(旱獺和犬的股骨、肝、脾)，分別接種3種選擇培養(yǎng)基，28℃孵箱培養(yǎng)24～48 h，觀察鼠疫菌生長及分離情況。在各選擇培養(yǎng)基上挑選可疑鼠疫菌菌落經(jīng)鼠疫噬菌體實驗確診為鼠疫菌，以上實驗均以1%溶血赫氏培養(yǎng)基為對照培養(yǎng)基。
1.2.7菌落計數(shù)參考《GB 4789.2—2016，菌落總數(shù)測定》。
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