Y群腦膜炎奈瑟菌對13種抗菌藥物敏感性試驗——摘要、材料與方法
摘要
目的了解海南省Y群腦膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis,Nm）流行病學、分子特征及對抗菌藥物的敏感性，為Y群流行性腦脊髓膜炎（流腦）的預防控制和治療提供科學依據。方法對海口市2022年5月發現的2例流腦病例患者血液標本和密切接觸者咽拭子進行腦膜炎奈瑟菌分離培養、生化和普通聚合酶鏈反應種屬鑒定，將得到的Nm用玻片凝集法和熒光聚合酶鏈反應進行血清分群和基因分群；用二代全基因組測序技術對7株Nm進行全基因組測序；用E-test試紙條法進行13種抗菌藥物敏感性試驗。結果2例患者都是青少年。從患者和密切接觸者中共獲得7株Nm分離株，其中2株來自患者，5株來自密切接觸者。7株Nm血清分群結果與基因分群結果一致，均是Y群Nm。所有分離株基因序列GC含量在51.84%~51.86%，序列型是ST-1655型，屬于ST-23克隆群。外膜蛋白porA（P1.5-1,10-1）、porB（3-117）和fetA（F4-1）基因分型結果均一致。7株Nm的耐藥相關基因序列完全相同。所有菌株對青霉素、氨芐西林、頭孢噻肟、頭孢曲松、美羅培南、氯霉素、阿奇霉素、米諾環素、利福平、環丙沙星、萘啶酸、左氧氟沙星敏感，對復方新諾明耐藥。結論海南省已發現ST-1655型血清Y群Nm感染病例，應加強該地區流腦菌群監測，推廣流腦ACWY群四價疫苗接種，防止Y群流腦發病和死亡。
流行性腦脊髓膜炎（epidemic cerebrospinal meningitis，ECM）簡稱流腦，是由腦膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis,Nm）引起的急性呼吸道傳染病，具有起病急、病情發展快和病死率高等特點。人是腦膜炎奈瑟菌唯一宿主，多數人感染后表現為隱性感染，少數人會引起流腦或侵襲性菌血癥。Nm根據莢膜多糖結構可分為12個血清群（A、B、C、X、Y、Z、E、W、L、H、I和K），其中A、B、C、X、Y和W是導致人類疾病常見的血清群。目前全球面臨多個血清群Nm流行和變遷威脅。我國近年A群、C群病例明顯減少，B群、W群、Y群病例呈增加趨勢。2022年5月海南省確診2例Y群流腦病例，并從流腦患者全血和密切接觸者咽拭子中分離到了7株Nm，現將其流行病學、分子特征和藥敏結果報告如下。
1材料與方法
1.1標本資料
病例1，男，19歲學生，天津市人，居住海口市瓊山區，2022年5月25日發病，26日采集全血樣本送檢，5月27日采集與患者密切接觸者（密接者）80份咽拭子現場接種雙抗巧克力平板送檢。病例2，男，15歲輟學學生，海南屯昌人，居住海口市龍華區，5月9日發病，5月27日采集全血培養瓶送檢。6月2日采集與患者密切接觸者57份咽拭子現場接種雙抗巧克力平板送檢。
1.2主要試劑與儀器
血平板、普通巧克力平板、雙抗平板（廣東環凱）；細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）試劑盒（德國QIAGEN公司）；Nm雙重核酸、Nm（A型、B型、C型）和Nm（X型、Y型、W135型）三重核酸檢測預分裝試劑盒（深圳市生科源）；NH奈瑟菌鑒定卡（法國生物梅里埃）；兔抗腦膜炎球菌診斷血清試劑（青島中創匯科）；羊血M-H平板（廣州迪景）；13種抗菌藥物E-test紙條（意大利liofilchem公司）。Nm基因組測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。儀器：二氧化碳（CO2）培養箱（德國Memmert公司）；ABI 7500熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；Tpersonal PCR儀（德國Biometra公司），Gel Doc XR+凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）。
1.3方法
1.3.1病原學檢測
將病例1全血、病例2血液培養瓶標本接種的血平板、巧克力平板和病例1的80份、病例2的57份密接者咽拭子雙抗平板，置5%CO2，36.5℃培養24~48 h。取疑似菌分純后做氧化酶試驗，VITEK 2 NH奈瑟菌生化鑒定。密接者分離株用普通聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction,PCR）進行Nm種屬鑒定。確定為Nm的菌株用腦膜炎奈瑟菌診斷血清進行玻片凝集試驗，基因分群使用商品化試劑盒熒光PCR擴增Nm莢膜轉運基因（ctrA基因）、銅-鋅超氧化物歧化酶基因（sodC基因）和A、B、C、W、X、Y群特異性基因。
1.3.2全基因組測序
提取基因組DNA，按QIAamp DNA Mini Kit說明書操作，每株菌提取4管，每管100μL送上海生工進行二代全基因組高通量測序，要求：基因組覆蓋度≥95%，基因區覆蓋度≥98%，整體覆蓋度≥100X，Scaffold個數<100個，Contig數量<200個，單堿基錯誤率低于1/105。測序質量控制：PE150及以上測序，原始數據量（堿基數）≥1.5 G，高質量測序數據（Q20）≥1 Gb，Q30比例≥85%。最終獲得拼接好的全基因組框架圖序列。將基因組框架圖序列上傳PubMLST網絡數據庫（https://pubmlst.org/neisseria）進行在線分析，獲得菌株序列型（sequence type,ST）、克隆群（clone complex,CC）、耐藥基因、疫苗相關蛋白基因以及外膜蛋白基因porA（包括可變區VR1和VR2）、porB和fetA的基因型和亞型。Nm基因亞型書寫按“血清群:porA VR1基因型，VR2基因型:fetA基因型:ST型（克隆群）”。
1.3.3藥物敏感性試驗
參考2019年美國臨床和實驗室標準協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的《抗微生物藥敏試驗執行標準》，采用微生物快速藥敏監測系統測定Nm菌株對13種抗菌藥物的最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration,MIC）。經鑒定的腦膜炎奈瑟菌接種巧克力平板36℃，5%CO2培養22 h，取菌落用3 mL滅菌生理鹽水制備濃度為0.5麥氏單位的菌液，直接涂布羊血M-H平板，每個M-H平板只能貼1根E-test試紙條，置36℃，5%CO2培養22 h后讀取MIC值，試驗同時用ATCC49619和ATCC25922做質控。結果判定按2019年CLSI推薦標準報告。
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