芐嘧磺隆降解菌株75B的生長曲線、生長及降解（二）
2結果與分析
2.1芐嘧磺隆降解菌株的分離與鑒定
利用長期使用野老除草劑的稻田土壤為材料，通過逐步提高培養基中芐嘧磺隆濃度的方法，經近兩個月的馴化及富集培養，最終分離純化獲得1個細菌菌株，該菌株在含50 mg/L芐嘧磺隆的MSM固體培養基平板上生良好，命名為75B。
降解菌株75B在LB固體平板上培養24 h后，呈現出半透明、光滑、隆起的乳白色光澤感菌落；鏡檢為G-的桿狀細菌(圖1)。生理生化測試表明，該菌株M.R試驗、V.P試驗、氧化酶及過氧化氫酶陰性；苯丙氨酸水解、淀粉水解、酪素水解陰性；硝酸鹽還原、纖維素分解、丙酸鹽利用陽性；有莢膜；可發酵葡萄糖、乳糖、核糖醇，不能利用山梨糖和5-酮基-D-葡萄糖酸。
利用16S rRNA基因擴增的通用引物，以75B菌株的總DNA為模板進行PCR擴增，擴增產物經電泳顯示擴增到1.5 kb大小目的條帶。測序產物經BLAST及EzTaxon-e服務器鑒定，構建系統發育樹(圖2)，表明75B菌株的16S rRNA基因與Klebsiellavariicola及Klebsiellapneumoniae同源性極高，分子鑒定為Klebsiellasp.。
結合生理生化測定及分子生物學方法，最終將芐嘧磺隆降解菌75B鑒定為Klebsiellapneumoniae(肺炎克雷伯氏菌)。
圖1芐嘧磺隆降解菌75B的菌落和鏡下Gram染色圖譜
2.2芐嘧磺隆降解菌株75B在不同環境條件下的生長
2.2.1降解菌株75B在不同培養基中的生長曲線當把降解菌株75B接種入LB、含50 mg/L芐嘧磺隆的LB培養基中，結果顯示出相似的生長趨勢；另外，在LB培養基中加入50 mg/L芐嘧磺隆后，降解菌株75B的生長稍稍有所滯后，表明芐嘧磺隆的加入對于芐嘧磺隆降解菌株仍然存在略微的影響，這主要表現在對數生長期的生長速率有所降低。但是，當培養至穩定期后期(24 h)，在兩種培養基中的菌體生長量(OD600值)并未有顯著差別(p0.05)(圖3)，降解菌株可以快速適應芐嘧磺隆的存在。
圖2芐嘧磺隆降解菌75B的16S rRNA基因系統發育樹
圖3芐嘧磺隆降解菌株75B的生長曲線
2.2.2培養基不同pH值及NaCl濃度對降解菌株生長的影響在不同pH值的LB培養基(含50 mg/L芐嘧磺隆)中，降解菌株75B的菌體生長量在對數生長期存在差異，pH 7.0的培養基中生長速率最快(p0.05)，最適pH值為7.0。進入穩定期后期，pH值對菌體生長量的影響下降，該菌株在pH 5.09.0范圍內生長良好，表明75B對環境pH值有較強的適應能力(圖4)。
2.2.3不同接種量及裝液量對降解菌株生長的影響設置4個不同接種量接種菌液，結果表明，在接種量為1%時，75B菌株的菌體生長量低于其余3個處理，而當接種量為5.0～10.0%范圍內時，菌體OD600值并無顯著差異(p<0.05)。因而，適當加大接種量可使菌體縮短適應期而進入快速生長階段，但接種量與菌體生長量之間并不呈完全對應增長趨勢，降解菌株75B的最適接種量為5.0%。而在3個不同的裝液體積下，菌體生長量并無明顯差異(圖5)。
注：上圖為不同pH值，下圖為不同NaCl濃度，*代表差異顯著(p<0.05)
圖4培養基不同pH值及NaCl濃度對芐嘧磺隆降解菌株75B生長的影響
2.2.4不同培養溫度對降解菌株生長的影響溫度通常對微生物的生長影響較大。在4個不同的溫度條件下培養75B菌株，34℃條件下的菌體生長量略高；除在培養初期(12 h)，測試的最低溫度(26℃)及最高溫度(38℃)下菌體OD600值略低于其余處理外；總體上，在26～38℃溫度范圍內，芐嘧磺隆降解菌株75B的生長良好，菌株可以耐受較廣的溫度范圍。
注：上圖為不同接種量，下圖為不同裝液量，*代表差異顯著(p<0.05)
圖5接種量及裝液量對芐嘧磺隆降解菌株75B生長的影響
圖6不同培養溫度對芐嘧磺隆降解菌75B生長的影響
2.3芐嘧磺隆降解菌株75B的生長及降解
將活化的75B菌株培養液以5%接種量、轉接入以芐嘧磺隆為唯一碳源的無機鹽培養基(pH 7.0，含2.0%NaCl)中，34℃搖床振蕩培養監測菌體生長量。結果表明，菌體在150 mg/L芐嘧磺隆的培養基中基本無生長；而50 mg/L和100 mg/L濃度下菌體的延滯期達3 d左右，之后OD600值開始逐漸呈上升趨勢。在含50 mg/L芐嘧磺隆的MSM培養基中，75B菌株的生長明顯優于另兩組處理(p0.05)(圖7)。收集該濃度下的菌體培養液，經萃取、蒸干后進行HPLC測定，顯示75B菌株對50 mg/L芐嘧磺隆的5 d降解率為74.11%，培養至10 d時的降解率高達97.65%(圖8)。
注：*代表差異顯著(p<0.05)
圖7降解菌株75B在以不同濃度芐嘧磺隆為唯一碳源MSM培養基中的生長
圖8芐嘧磺隆降解菌株75B對50 mg/L芐嘧磺隆的降解能力
3結論
芐嘧磺隆是20世紀80年代中期開發的一種新型磺酰脲類除草劑，是我國水稻田中使用面積廣、時間長、用量大的除草劑之一。由于其在土壤中的持效期較長，大量施用后會對環境造成一定危害。本研究采集長期施用野老除草劑(含芐嘧磺隆6%)的稻田土壤，經富集、馴化后分離到1株芐嘧磺隆降解菌株75B，形態學、生理生化研究及分子生物學研究結果顯示該菌株為Klebsiellapneumoniae(肺炎克雷伯氏菌)，該菌株對環境的適應能力較強，生長在pH 7.0、含50 mg/L芐嘧磺隆的無機鹽培養基(2.0%NaCl)中，34℃條件下培養10 d，對芐嘧磺隆的降解率可達97.65%。
Zhu等在2005年首次報道可降解芐嘧磺隆的短桿菌屬(Brevibacteriumsp.)BH菌株，在2535℃條件下、pH7.07.5時，培養7 d對100 mg/L BSM的降解率為29.4%。張松柏等從農藥廠工業廢水和污泥中富集分離到光合細菌PSB07-6，鑒定為Rhodopseudomonaspalustris(沼澤紅假單胞菌)，在pH6.5的光合細菌培養基中30℃條件下培養5 d后，對350 mg/L芐嘧磺隆的降解率為25.03%。Lin等分離到BacillusmegateriumL1菌株，培養84 h對50 mg/L BSM的降解率為12.8%。Xiong等篩選到的Rhodococcussp.BX2菌株對20 mg/L BSM的7d降解率為92%。除此外，彭星星等分離篩選到的芐嘧磺隆降解真菌Aspergillussp.BP-H-01菌株，最適pH 7.5、28℃條件下對25 mg/L BSM的2 d降解率為84.5%。Peng等分離到Penicilliumpinophilum(嗜松青霉)BP-H-02菌株，在30℃條件下置于pH 6.5的培養基中，對50 mg/L BSM的60 h降解率為87%。以上報道的芐嘧磺隆降解菌株最適pH值均為中性或酸性條件。Sabadie等的研究表明BSM在土壤中主要經化學水解和生物學降解進行，其化學水解是pH依賴性的、在酸性或中性條件下(pH8.0)可通過脲橋斷裂水解形成穩定的嘧啶胺和苯甲磺酰氨。本研究獲得的Klebsiellapneumoniae75B菌株在堿性條件下(pH 7.09.0)生長良好，更有利于堿性土壤中生物降解的進行。另外，該菌株的溫度適應范圍(2638℃)更廣、對50 mg/L芐嘧磺隆的5 d降解率可達74.11%，培養至10 d時幾乎可完全降解，是一株降解效果優良的菌株，對于該菌株的進一步研究可為其用于污染土壤的生物修復奠定基礎。
Klebsiella屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，在環境中廣泛存在，其分離株或具有內生性固氮作用、或者是條件性致病菌。Klebsiellapneumoniae是可定殖和感染多種動植物的克雷伯氏菌屬成員。早期的研究表明該菌為條件性致病菌，可致人肺炎及奶牛乳腺炎。近年來發現Klebsiellapneumoniae分離株具有代謝多樣性，占據了不同類型的環境生態位；菌種的不同分離株也表現出遺傳和表型的多樣性。多位研究者發現在玉米或水稻中有該種微生物內生定殖并具有固氮活性，而且玉米分離株較臨床分離株的毒力更低。Klebsiellapneumoniae不同地區分離株還被報道具有降解石油、降解苯并芘和芘，可利用單寧酸等多種能力。本研究中分離到的Klebsiellapneumoniae菌株被首次發現還具有降解芐嘧磺隆的能力，也充分表明了該種微生物具有一定的環境生物修復潛能。
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