甘肅隴南油橄欖葉提取物對幾種常見細菌生長曲線的影響
隨著抗生素類和磺胺類等抗菌藥物的大量使用，細菌的耐藥性不斷增強。因此，研發高效、廣譜、低殘留、低毒的藥物將成為防治細菌感染類疾病的重中之重。研究發現中藥或天然植物提取物可抑制或直接殺滅病原菌而不產生耐藥性[6-7]，因此抗菌中藥逐步成為研究熱點。而橄欖苦苷作為一種裂環烯醚萜類化合物，對細菌具有較強的抑制效果。本文以甘肅隴南油橄欖葉提取物(Olive leaves extract，OLE)為試樣，分析其對幾種常見細菌的抑菌活性，為油橄欖葉提取物制備成抗菌制劑提供實驗依據和理論基礎。
測試方法
采用稀釋法[10]分析OLE對8種供試細菌生長曲線的影響。依次將菌懸液和不同質量濃度的OLE溶液加入滅菌后的牛肉膏蛋白胨液體培養基中，37℃、160 r/min振蕩培養。每隔6 h置于超凈工作臺內取樣一次，于540 nm波長處測定其吸光度，繪制細菌生長曲線。
測試結果
OLE對芽孢桿菌生長曲線的影響(見圖1)
注：A為蠟狀芽孢桿菌，B為枯草芽孢桿菌。
由圖1(A)可知，在不添加OLE的培養基中，蠟狀芽孢桿菌在培養12 h后細菌生物量的積累明顯加快，12～30 h為蠟狀芽孢桿菌的對數生長期。添加OLE質量濃度為5 mg/mL溶液的培養基中蠟狀芽孢桿菌在培養18 h后適應環境并快速繁殖，在18～24 h處于對數生長期，與對照組比較，此時細菌的對數生長期相對延緩，說明OLE對蠟狀芽孢桿菌的生長有一定的抑制作用。當添加OLE質量濃度為10 mg/mL的溶液時，培養到18 h后蠟狀芽孢桿菌開始迅速增長，在培養18～24 h時處于對數生長期，但菌體濃度低于5 mg/mL組，表明蠟狀芽孢桿菌隨著OLE質量濃度的增加，對數生長期被相應延緩或推遲。由圖1(B)可知，當不添加OLE時，培養到6 h后枯草芽孢桿菌開始增長，在培養6～30 h時處于對數生長期。OLE質量濃度為5 mg/mL時，在培養18 h后枯草芽孢桿菌快速生長并進入對數生長期。在OLE質量濃度為10 mg/mL時，培養24 h后枯草芽孢桿菌增長明顯加快，24～30 h為快速生長期。表明隨著OLE質量濃度的增加，枯草芽孢桿菌的延遲期增長，對數生長期延后。實驗發現蠟狀芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌對數生長期分別為12～30 h、6～30 h，添加不同質量濃度的OLE后均可延緩蠟狀芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌進入對數生長期。生長曲線遲緩期的長短主要因菌種、接種量、菌齡及營養物質等不同而異。本實驗中遲緩期延長的原因可能是OLE中的活性成分作為菌體生長的抑制劑對其生長起到了抑制作用。
OLE對大腸桿菌生長曲線的影響(見圖2)
注：A為抗四環素大腸桿菌，B為大腸桿菌。
由圖2可知，抗四環素大腸桿菌組和大腸桿菌組的生長曲線趨勢趨于一致。不添加OLE時，培養6 h后細菌數開始快速增長并進入對數生長期。當OLE質量濃度為5 mg/mL時，抗四環素大腸桿菌和大腸桿菌的對數生長期為18～30 h，此時對數生長期被延緩，細菌生長速率減慢且所需時間范圍變寬。當OLE質量濃度為10 mg/mL時，抗四環素大腸桿菌和大腸桿菌在培養18 h后細菌數迅速增加，在18～30 h為對數生長狀態，但菌體濃度低于5 mg/mL組。圖2(A)表明添加OLE既可以延緩抗四環素大腸桿菌進入對數生長期的時間，又可以降低其菌體生長量，OLE對該菌株有較強的抑制作用。圖2(B)表明OLE對大腸桿菌的抑制作用相對較弱。油橄欖葉中酚類物質具有抗腫瘤、抗癌作用，此外還有廣泛的抑菌和抗氧化作用，如橄欖苦苷、蘆丁、咖啡酸等及其一定比例混合物均顯示較強的體外活性，具有聯合抗菌作用。Lee等[14]發現橄欖葉提取物中的橄欖苦苷和咖啡酸均表現出對微生物的抑制作用，且組合酚類化合物的抗菌效果顯著高于酚類化合物單體。
OLE對葡萄球菌生長曲線的影響(見圖3)
注：A為表皮葡萄球菌，B為金黃色葡萄球菌(SH7)，C為金黃色葡萄球菌。
由圖3(A)可知，不添加OLE的培養基中表皮葡萄球菌培養12 h左右進入對數生長期，培養24 h時進入平穩期，之后細菌數開始快速降低。OLE質量濃度為5 mg/mL時，表皮葡萄球菌在培養18 h之后細菌數增加較快，18 h左右進入對數生長期，培養30 h后達到最大菌液濃度，此時表皮葡萄球菌對數生長期相對對照組被延緩，說明OLE對表皮葡萄球菌有一定抑菌作用。在OLE質量濃度為10 mg/mL時，表皮葡萄球菌在培養6 h后繁殖較快，數目增加明顯，18 h左右進入對數生長期，培養30 h后細菌數開始下降。由圖3(B)可知，當不添加OLE時，金黃色葡萄球菌(SH7)在開始培養后持續快速增長。OLE質量濃度為5 mg/mL時，培養6 h細菌開始適應環境，12 h后快速生長，對數生長期出現在培養12～36 h之間。OLE質量濃度為10 mg/mL時，金黃色葡萄球菌(SH7)生長曲線趨勢與5 mg/mL組相一致。由圖3(C)可知，不添加OLE時，培養6 h后金黃色葡萄球菌進入對數生長期。OLE質量濃度為5 mg/mL時，培養12 h后金黃色葡萄球菌菌數開始增加，18 h后進入對數生長期，相比對照組，此時對數生長期被延緩，細菌生長速率減慢。當OLE質量濃度為10 mg/mL時，金黃色葡萄球菌在培養18 h后細菌數迅速增加，于18 h達對數生長狀態。以上結果表明，OLE對葡萄球菌生長曲線的對數生長期均具有延緩作用。吳遵秋等[12]利用稀釋法分析了橄欖苦苷對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌生長曲線的影響，結果顯示橄欖苦苷對3種細菌生長曲線的影響均表現為延緩細菌的對數生長期，與本研究結果類似。植物源提取的酚類物質具有廣譜的抑菌性，特別是黃酮類化合物，從不同物種中提取的黃酮類化合物抑菌作用均不相同。橄欖黃酮對變形桿菌有較強的抑制作用，對痢疾桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用更強；橄欖黃酮對牛乳中微生物的活動同樣具有抑制作用，而且隨著橄欖黃酮濃度的增加，抑菌作用明顯增加[15]。OLE對細菌對數生長期的延緩作用是其中多種活性物質相互協同作用的結果。
OLE對銅綠假單胞菌生長曲線的影響(見圖4)
圖4不同質量濃度OLE對銅綠假單胞菌生長曲線的影響
由圖4可知，與對照組相比，當OLE質量濃度為5 mg/mL時，對銅綠假單胞菌的生長抑制作用較小，但是當OLE質量濃度增至10 mg/mL時，生長抑制作用較明顯，尤其是在生長后期。結果表明在實驗質量濃度范圍內，OLE對銅綠假單胞菌的生長抑制作用與其質量濃度直接相關。已有的研究顯示橄欖黃酮和橄欖多酚對桿菌、葡萄球菌均有較強的抑制作用，且隨著濃度的增加抑菌作用明顯增加[15-16]。因此，橄欖葉提取物中有效成分濃度與抑菌活性之間存在顯著的正相關性。