豨薟草果實內生細菌分離、鑒定、生長特性、抑菌效果及藥敏分析（二）
2結果
2.1內生細菌的分離及抑菌效果
如表1所示，從豨薟草果實中共分離得到15株內生細菌，其中具有抑菌活性的8株，較明顯的3株，編號為C-2、C-4、C-5-1，尤以菌株C-5-1的效果最好，對提供的幾種病原細菌均顯示出一定的抑制作用（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌中度敏感以上），圖1為菌株C-5-1對銅綠假單胞菌的抑菌活性。說明該菌株是一種廣譜的抗感染細菌且效果顯著，具有較高的研究價值和應用前景。因此，本研究后續實驗的開展就是以C-5-1為實驗菌株。
表1豨薟草果實內生拮抗細菌的抑菌篩選
圖1菌株C-5-1（A、C）和C-6（B、D）對銅綠假單胞菌的抑菌效果
2.2菌株C-5-1的鑒定分析
光學顯微鏡染色觀察，菌株C-5-1的細胞呈桿狀，芽孢側生。革蘭氏染色結果可變，對數期時染色結果為陽性，穩定期時變為陰性。
通過表2所得的16項生理生化試驗結果，結合形態學特征，依據《伯杰氏細菌系統鑒定手冊》，判斷該菌株可能是側孢短芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporus）。
以菌株C-5-1的基因組DNA為模板，PCR擴增和測序獲得了16S rRNA基因的部分片段（1 438 bp），NCBI GenBank登錄號為KX170837。選擇同源性較近的菌株與C-5-1構建系統發育進化樹，結果顯示（圖2）該菌株與側孢短芽孢桿菌的同源關系最近。結合形態學和生理生化鑒定結果，確定為側孢短芽孢桿菌，該菌株被命名為C-5-1。
表2 C-5-1部分生理生化特征
圖2基于16S rRNA基因序列相似性構建的系統發育樹
2.3藥敏分析
藥敏試驗結果（表3）表明，5種指示菌對氨芐西林均完全耐藥，而本研究所分離得到的菌株C-5-1對氨芐西林是高度敏感的。因此，在后續摸索抗菌代謝物的純化方案中，可以向LB固體培養基中加入適宜濃度的氨芐西林，以抑制發酵液和純化液中菌株C-5-1的生長，而指示菌（銅綠假單胞菌）正常生長。
表3五種指示菌與側孢短芽孢桿菌C-5-1的藥敏分析
2.4菌株C-5-1的生長特性
分別測定細菌在不同酸堿度和鹽度的生長特性，從而為該菌株的進一步培養和發酵利用提供依據。結果（表4）顯示，側孢短芽孢桿菌C-5-1在低pH環境中耐受性有限，在pH≤5.0時幾乎沒有生長，但在pH≥7.0時生長良好，并且隨著pH值的升高，菌體量也一直在增加，這說明該菌株耐堿不耐酸。菌株C-5-1在NaCl鹽度≤5%（相當于50 g/L）時正常生長，但隨著鹽度的增加該菌株的生長受到了一定的抑制，當鹽度≥15%時，其生長受到了完全抑制甚至死亡。這是因為不同鹽度能形成不同滲透壓環境，造成細胞不同程度的脫水，從而降低生長速率，甚至失活。
表4側孢短芽孢桿菌C-5-1生長特性值
2.5菌株C-5-1抗菌代謝產物的初步純化
由表5可知，側孢短芽孢桿菌C-5-1發酵液的乙酸乙酯相和水相都有明顯的抑菌圈，直徑分別為（28.3±0.8）mm和（29.9±0.5）mm，指示菌為銅綠假單胞菌，這說明該菌株不止產生一種抗菌物質。后又通過超濾離心管對二者進行了純化，研究表明這兩種抗菌代謝產物的分子量均小于2 000。
表5側孢短芽孢桿菌C-5-1純化液的抑菌活性
3討論
內生細菌在適宜生境中能通過發酵獲得大量目的活性產物，從而可以緩解某些藥用植物資源短缺、生長周期長、生態系統損害等現象，并能為新藥開發與瀕危藥用植物保護等難題提供重要思路。由于病原菌耐藥性增加等問題的日益凸顯，使得尋求天然、高效、綠色的替代品更加重要。
側孢短芽孢桿菌最初是由Laubach于1916年從淡水中分離得到，并根據它的形態及生理生化特性將其歸為芽孢桿菌屬，到1996年，Shida等按近代生物分類學將其重新劃分為短芽孢桿菌屬。據報道側孢短芽孢桿菌具有廣譜抗菌活性，尤其是對細菌和真菌。近期的全基因組測序結果表明，側孢短芽孢桿菌還具有產生聚酮化合物和非核糖體肽等多種抗感染藥物的潛力，因此其醫用功能潛力巨大。Barsby等從巴布亞新幾內亞海岸熱帶海水中分離得到一株側孢短芽孢桿菌，能產生聚酮類Basiliskamides等多種化合物，可以有效抑制大腸埃希菌和白色念珠菌。同樣也是從海洋中分離得到的菌株PNG276能明顯地抑制腸球菌的生長。Yang等從菌株OSY-I1分離到一種能抗革蘭氏陽性菌生長的脂肽抗生素Brevibacillin。本研究從豨薟草果實中獲得一株具有較強抗感染活性的耐堿側孢短芽孢桿菌C-5-1，并且結合其代謝產物的物化性質，推測它們可能是新型抗菌物質。預示著該菌株具有非常高的開發價值，極可能取代部分抗生素進行應用。
由于后續對菌株C-5-1抗感染活性的研究是以其代謝產物為主，為了降低成本和縮短時間，本研究開展了實驗菌株C-5-1與5種指示菌的藥敏試驗，以期篩選到對C-5-1高度敏感而對指示菌耐藥的抗生素，結果表明氨芐西林能滿足此要求。在測量抑菌活性時，首先向熔化的固體培養基中加入適宜濃度的氨芐西林，然后指示菌涂布于平板表面，并將待測樣品直接置于平板中央0.8 cm的孔中。如果按傳統做法，樣品需要經過孔徑為0.22μm的濾膜過濾后再加入。
4結論
豨薟草可作為優良微生物資源的來源，從而為開發新型天然抗感染藥物提供寶貴的資源。
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