?菌落計(jì)數(shù)儀的計(jì)數(shù)和培養(yǎng)步驟、稀釋標(biāo)準(zhǔn)及注意事項(xiàng)
菌落形成單位CFU（colony forming unit）用來估算固體或液體樣品中存活的細(xì)菌或真菌細(xì)胞數(shù)量的單位，通常以CFU/g或CFU/mL的形式表示。活菌數(shù)用CFU表示，表示在適宜的環(huán)境條件下，在固體培養(yǎng)基上生長繁殖所形成的菌落數(shù)。但，菌落形成單位CFU并不等于實(shí)際活菌數(shù)，而是對活菌數(shù)的估值。單菌落有可能由一個菌生長繁殖而成，也可能由多個菌生長繁殖而成，所以有必要用到一些儀器，比如：BioSense微生物快速立體計(jì)數(shù)儀。
樣品的稀釋固體和半固體樣品
稱取25 g置盛有225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000 r/min～10000 r/min均質(zhì)1min～2 min，或放入盛有225 mL稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2 min，制成1:10的樣品勻液。
液體樣品以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。
上步完成后，用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于盛有9mL稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。移液過程使用的器具，都應(yīng)避免微生物污染。使用耐高壓移液槍，核查洗耳球無菌程度，避免移液槍觸及均質(zhì)袋或試管內(nèi)壁……樣品勻液完成后，可按相同操作，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1mL無菌吸管或吸頭。根據(jù)對樣品污染狀況的估計(jì)，選擇2個～3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進(jìn)行10倍遞增稀釋時，吸取1 mL樣品勻液于無菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿。同時，分別吸取1 mL空白稀釋液加入兩個無菌平皿內(nèi)作空白對照。
之后，及時將15 mL～20 mL冷卻至46℃的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（可放置于46℃±1℃恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，并轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻。培養(yǎng)和計(jì)數(shù)
樣品稀釋完成后，就要進(jìn)行培養(yǎng)和菌落計(jì)數(shù)了。
待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h。水產(chǎn)品30℃±1℃培養(yǎng)72h±3h。
如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長的菌落時，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4mL），凝固后翻轉(zhuǎn)平板，按相同條件進(jìn)行培養(yǎng)。
培養(yǎng)完成后，就要進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)了，計(jì)數(shù)可用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（colony-forming units,CFU）表示。
選取菌落數(shù)在30 CFU～300 CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30 CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300 CFU的可記錄為多不可計(jì)。每個稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個平板的平均數(shù)。
大片菌落其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個平板后乘以2，代表一個平板菌落數(shù)。鏈狀生長當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計(jì)數(shù)。
結(jié)果與報(bào)告
為了生成結(jié)果和報(bào)告，需要根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果和公式計(jì)算出菌落總數(shù)。需要注意的是，對于菌落數(shù)量不同的培養(yǎng)皿，計(jì)數(shù)原則有所不同。若所有平板上為蔓延菌落而無法計(jì)數(shù)，則報(bào)告菌落蔓延。若空白對照上有菌落生長，則此次檢測結(jié)果無效。稱重取樣以CFU/g為單位報(bào)告，體積取樣以CFU/mL為單位報(bào)告。
按照什么標(biāo)準(zhǔn)去稀釋？
1.參考值
其實(shí)，這個是最靠譜的方法，有個參考值就可以直接稀釋后涂布。這里的“參考值”有可能是估值，也可能是樣品本身標(biāo)注的值。對于有經(jīng)驗(yàn)的人，其實(shí)有沒有參考值，總是能夠計(jì)數(shù)。但，對于新手來說，如果沒有，根本無從下手。
2.擴(kuò)大計(jì)數(shù)范圍
比如，稀釋到10-8，感覺稀釋倍數(shù)差不多，涂布的時候選擇10-8，10-7，10-6，每個梯度三個平板。再選擇10-9，10-5，10-4，每個梯度一個平板，留個對照。即使菌落數(shù)計(jì)不出來，也能出個參考值、估測值。
3.巧妙利用光學(xué)顯微鏡
比如，稀釋到10-8，感覺稀釋倍數(shù)差不多，采用單染色法，在顯微鏡下觀察，如果沒有觀察到菌，稀釋倍數(shù)往前數(shù)；如果能夠觀察到1～5個菌，就按照這個稀釋倍數(shù)；如果大于5個菌，繼續(xù)稀釋一個梯度；如果看到一片，你清楚怎么處理。
4.巧妙利用血球計(jì)數(shù)板
比如，稀釋到10-8，感覺稀釋倍數(shù)差不多，用血球計(jì)數(shù)板大概看一下菌數(shù)，推算菌落總數(shù)，看是否符合計(jì)數(shù)要求。
注意事項(xiàng)
1.巧妙利用玻璃珠進(jìn)行研磨，即使是液體樣品也需要進(jìn)行研磨，盡量將菌落打散。
2.盡量涂布均勻，覆蓋整個平板表面。實(shí)在涂不好，可以選擇傾注。
3.能用試管稀釋就不要用離心管稀釋。
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