拮抗菌生長曲線測定、鑒定及對煙草赤星病室內防治效果（一）
由鏈格孢菌（Alternaria alternata）引起的煙草赤星病主要危害成熟期的烤煙上部葉，發病嚴重地塊幾乎絕收，嚴重影響煙葉產質量。目前化學防治依然是防治煙草赤星病的主要措施，然而長期使用化學藥劑易造成環境污染、農藥殘留和危害人畜健康等問題，且近年來有研究報道鏈格孢菌對96%（質量分數）苯醚甲環唑和97%（質量分數）氟環唑及93%（質量分數）菌核凈等藥劑已產生抗藥性。而生物防治具有無毒、無殘留和對環境友好等優點，成為植物病害防治研究的熱點之一。
目前，植物病害生物防治中應用最廣泛的為芽胞桿菌屬細菌，因其有抗菌譜廣、耐鹽性強、能產生多種拮抗作用酶、繁殖快、抗逆性強和生物安全性高等優點，具有較高應用價值。宋莉莎等從貴州省甕安縣煙區土壤中篩選具有拮抗作用的細菌發現，甲基營養型芽胞桿菌（Bacillus methylotrophicus）對鏈格孢菌有較強的抑制作用，其無菌發酵液對該病菌抑菌帶可達23.5 mm。從福建、山東和云南等地煙草葉片中分離得到187株菌株，發現萎縮芽胞桿菌（Bacillus atrophaeus）與貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis）分泌的脂肽類物質對鏈格孢菌菌絲生長也有明顯抑制作用，抑制率分別為56.9%和65.0%。
前期調查發現，貴州省清鎮市衛城鎮煙區煙草赤星病發生嚴重，部分地塊發病率高達100%，幾乎絕收，給當地煙農造成巨大經濟損失。為篩選對該地區煙草赤星病具有拮抗作用的菌株，采用5點取樣法，從貴州省清鎮市衛城鎮煙草赤星病發生嚴重地塊采集健康煙株根際土壤，帶回實驗室進行芽胞桿菌分離純化，使用平板對峙法篩選對病原真菌具有較好拮抗作用的菌株，根據形態特征、生理生化指標及構建系統發育樹對其進行鑒定，并通過盆栽試驗測定該拮抗菌L249對煙草赤星病防治效果，旨在為煙草赤星病的生物防治提供依據。
1材料與方法
1.1材料與試劑
供試土樣采集于貴州省清鎮市衛城鎮煙草赤星病發生嚴重地塊健康烤煙根際，采用5點取樣法取樣后用無菌自封袋封存并編號。供試病原菌為鏈格孢菌（Alternaria alternata）、高粱葉點霉菌（Phyllosticta sorghina）、大斑突臍蠕孢菌（Exserohilum turcicum）、煙草炭疽菌（Colletotrichum nicotianae）和尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum），均由貴州大學煙草學院病理實驗室保存并提供。供試烤煙品種為K326，選用長53 mm、寬35 mm、高58 mm規格的育苗盆育苗，每盆1株，待烤煙幼苗生長至5片真葉時，移栽至底徑為140 mm、口徑180 mm、高160 mm花盆中繼續生長至8~10片葉備用。
供試藥劑為10%苯醚甲環唑水分散粒劑（WDG）（先正達南通作物保護有限公司），供試試劑有1%（質量分數）草酸銨結晶紫、明膠及9%（質量分數）NaCl溶液等。
1.2方法
1.2.1土壤拮抗菌分離
采用稀釋涂布平板法，稱取10 g土樣放入含90 mL無菌水的錐形瓶中，置于37℃、200 r/min恒溫搖床振蕩20 min。85℃水浴處理10 min后梯度稀釋得到濃度為10-2、10-3、10-4和10-5的土壤懸浮液。取100μL稀釋液均勻涂布于LB平板，各濃度3個重復，于37℃恒溫培養箱中過夜培養。待平板長出單菌落后，挑取形態不同的單菌落純化后編號，置于LB液體培養基中37℃振蕩培養24 h后，與30%（體積分數）甘油等比例混合后置于凍存管中，-80℃保存備用。
1.2.2拮抗菌抑菌譜測定
將5種植物病原真菌在PDA培養基上培養7 d后，分別取直徑為6 mm的菌餅接種到PDA平板中央（培養皿直徑為85 mm），距中央2.5 cm處再接種5μL拮抗菌菌液，以只接種病原菌的PDA平板為對照，每種病原菌接種4個培養皿，重復3次（下同）。待對照長滿培養皿后，測量抑菌帶寬度并挑取鏈格孢菌邊緣菌絲，置于Axio Imager M2蔡司金相顯微鏡（德國Carl Zeiss Microscopy GmbH公司）下觀察菌絲形態。采用十字交叉法測量菌落直徑，并計算菌絲生長抑制率。
生長抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）*100%
1.2.3拮抗菌生長曲線測定
將保存的拮抗菌活化后挑取單菌落接種到裝有5 mL LB培養液的試管中，置于37℃、200 r/min條件下的搖床中培養12 h后，獲得種子液。使用移液槍吸取1 mL種子液接種于100 mL的LB培養液中進行培養，采用比濁法，每隔30 min用分光光度計在600 nm波長處測定菌液的吸光度值（OD），直至OD值緩慢下降時停止測量。
1.2.4生物膜測定
將活化的芽胞桿菌接種于LB培養基中，37℃、200 r/min培養至OD600約為1.0時，4℃離心收集菌體，用無菌水洗滌后重懸于等體積的MSgg培養基中。取5 mL MSgg培養基加入12孔細胞培養板中，然后分別滴加10μL菌懸液，于37℃靜置培養24 h后觀察成膜情況。
1.2.5拮抗菌生防相關酶類測定
將篩選出具有良好拮抗作用的菌株接種于LB液體培養基中，置于37℃、200 r/min的搖床中過夜培養后，滴加5μL菌液至蛋白酶檢測培養基和纖維素酶檢測培養基中央，37℃培養箱中培養24 h后觀察菌落周圍是否產生消解圈。
1.2.6拮抗菌鑒定
結合形態特征、生理生化指標及構建系統發育樹分析方法對篩選的拮抗菌進行鑒定。
（1）菌落形態觀察：將活化后的菌株接種于LB液體培養基中過夜培養，取5μL菌液接種于LB平板中央并置于37℃培養箱中過夜培養，24 h后觀察菌落形態特征。
（2）生理生化指標：參考《常見細菌系統鑒定手冊》和《伯杰氏細菌鑒定手冊》，對拮抗細菌進行革蘭氏染色、酶的水解、明膠的液化、檸檬酸鈉鹽的利用、吲哚試驗、V-P試驗、甲基紅試驗及耐鹽試驗等多項生理生化特征分析。
（3）16S rDNA、gyrA序列擴增及系統發育分析：使用BioTeke細菌基因組DNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司），提取拮抗菌株DNA。利用細菌通用引物16S rDNA及gyrA對提取的細菌DNA進行PCR擴增后，采用1.0%（質量分數）瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，PCR擴增產物送生工生物工程（北京）股份有限公司測序。測序結果修正后經NCBI進行BLAST初步比對，根據比對結果下載親緣關系較近的序列及模式菌株（表1），在BioEdit 7.0軟件上對各菌株的序列進行修正后，以黃熱厭氧芽胞桿菌（Anoxybacillus flavithermus）為外群，使用MEGA 5.0軟件并采用最大似然法（Maximum Likelihood，ML）構建多基因系統發育樹。
表1用于構建系統發育樹的菌株號及GenBank登錄號①
1.2.7拮抗菌防治煙草赤星病盆栽試驗
待烤煙生長至8~10片葉時進行處理，采用噴霧法將濃度為1×108 cfu/mL的拮抗菌發酵液均勻噴施在煙草葉片正面，以液滴不滴落為標準，晾干后在葉片上接種在PDA培養基上培養7 d、直徑為6 mm的鏈格孢菌菌餅，每片煙葉接種4個菌餅。試驗設4個處理：以噴施無菌水的煙株為CK1；噴施無菌水晾干后接種病原菌的煙株為CK2；噴施發酵液晾干后接種病原菌的煙株為處理3；噴施2 000倍液10%苯醚甲環唑WDG晾干后接種病原菌的煙株為處理4。每處理3個重復，每個重復10株煙苗。置于光照和黑暗各12 h、溫度為28℃、相對濕度為90%以上的溫室中培養，直至CK2出現明顯病斑時，根據赤星病病害分級標準進行病害調查（以葉片為單位），并計算發病率、病情指數和相對防效。
計算公式：
1.3數據分析
使用Excel 2010軟件對數據進行統計處理，運用DPS數據處理系統Duncan’s新復極差法對試驗數據進行差異顯著性檢驗。
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