大腸桿菌噬菌體Bp4抗性菌株與其敏感菌株培養特性及耐藥性檢測（二）
2.3敏感菌株與抗性菌株基因組差異的分析
將敏感菌株與抗性菌株分別測序。結果顯示，O78型敏感菌株與O78-R抗性菌株基因組全長均為4 798 435 bp。兩組測序數據的比對分析結果顯示，抗性菌株中有3個堿基發生突變，分別位于3個重疊群（contig）中（表1）。
表1顯示，3個堿基的突變涉及到3個氨基酸，分別為乙醛脫氫酶的N→Y，十一碳二烯磷酸α-N-乙酰氨基葡萄糖磷酸轉移酶1的W發生無義突變，以及UpfB蛋白L發生同義突變。致噬菌體發生抗性的原因很可能為contig00024中65 018 nt處的堿基突變，密碼子由TGG變為TAG，編碼的氨基酸由色氨酸突變為終止密碼子，從而致蛋白質翻譯提前終止，致使抗性菌株的葡萄糖磷酸轉移酶由敏感菌株的372個氨基酸縮短為133個氨基酸，不能執行正常的酶功能（圖3）。
表1抗性菌株突變點的信息
圖3敏感菌株O78與抗性菌株O78-R氨基酸序列比對
2.4敏感菌株與抗性菌株的血清型鑒定
采用玻板凝集法對O78型敏感菌株及O78-R抗性菌株進行血清型鑒定，結果顯示，O78型敏感菌株與O78抗血清呈明顯的凝集現象，液滴邊緣出現麩皮樣顆粒狀的凝集片，液體清亮；O78-R抗性菌株與O78抗血清的凝集現象不明顯，液體渾濁，且有少量細微顆粒。表明敏感菌株確為O78血清型，而抗性菌株血清型發生了改變，已不能鑒定為O78血清型。
2.5敏感菌株與抗性菌株的藥敏試驗
采用藥敏紙片法分別檢測O78型敏感菌株與O78-R抗性菌株的藥物敏感性。結果顯示，與敏感菌株相比，O78-R抗性菌株對替米考星、環丙沙星、氨曲南、妥布霉素的抑菌圈直徑增大，耐藥性降低（表2），表明噬菌體抗性菌株比其敏感菌株對以上抗生素更敏感。
表2藥敏試驗結果
2.6敏感菌株與抗性菌株對小鼠的致病性試驗結果
將敏感菌株與抗性菌株的增殖液經腹腔接種小鼠，記錄小鼠的體況計分及存活率。結果顯示，抗性菌株接種的小鼠未出現死亡，在感染后0～48 h小鼠體況計分一直維持在45分以上，之后略有下降（圖4A）；而敏感菌株接種的小鼠在接種后72 h內共死亡4只，體況計分比抗性菌株接種的小鼠約低30分（圖4B），表明噬菌體抗性菌株對小鼠的致病性降低。
圖4兩組小鼠的體況計分（A）及存活率（B）統計結果
3討論
為了研究噬菌體的抗性突變大腸桿菌菌株與其敏感菌株的差異，本研究經雙層平板法篩選出對噬菌體具有抗性的大腸桿菌突變菌株，雖然在形態及培養特性上該抗性菌株與其敏感菌株未表現出差異，但該抗性菌株不再與O78抗血清發生強陽性的凝集反應，不再屬于O78血清型。
基因組測序及分析結果顯示，敏感菌株與抗性菌株基因組的全長一致，證明抗性菌株并無基因缺失和插入，但在抗性菌株中出現3處堿基的突變，導致1個同義突變，1個氨基酸替換（乙醛脫氫酶）以及1個無義突變。乙醛脫氫酶負責催化乙醛氧化為乙酸的反應，參與細菌的代謝，與噬菌體的感染無關。無義突變導致抗性菌株的十一碳二烯磷酸α-N-乙酰氨基葡萄糖磷酸轉移酶1的翻譯提前終止，而該蛋白參與細菌外膜中脂多糖O抗原的生物合成途徑[10]，導致脂多糖O抗原的合成受到抑制，提示該蛋白的突變是導致噬菌體不能感染抗性菌株的原因。本研究所用的噬菌體Bp4屬于短尾噬菌體科，為N4類噬菌體[11]，短尾噬菌體中N4類噬菌體G7C識別大腸桿菌表面的脂多糖受體[12]，T7類噬菌體尾部蛋白識別的也是宿主菌表面的脂多糖受體[13]，推測脂多糖也是噬菌體Bp4的受體。大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，細胞壁外膜中鑲嵌大量的脂多糖[14]。革蘭氏陰性菌的脂多糖由3部分組成：從內向外依次為脂質A、核心多糖、多糖側鏈，多糖側鏈又稱為O-抗原，當脂多糖中的任何一部分缺失均會對脂多糖的合成造成影響。本實驗中篩選的抗性菌株是由于堿基突變導致了色氨酸變為終止密碼子，致脂多糖中參與O抗原生物合成的N-乙酰葡萄糖胺磷酸轉移酶的翻譯提前終止。通過凝集試驗鑒定敏感菌株與抗性菌株的O抗原，結果顯示敏感菌株為典型的O78血清型，而抗性菌株不再與O78抗血清發生凝集，不能鑒定為O78血清型。該結果證實O抗原是噬菌體Bp4識別并吸附宿主菌的關鍵受體。大腸桿菌的O抗原類型與其致病性有直接相關性，每株大腸桿菌只含有一種O抗原，能致雞大腸桿菌病的常見血清型為O1、O2、O35及O78[15]。本研究獲得的噬菌體抗性菌不再具有O78抗血清的凝集性，提示細菌的致病性可能下降。樂率等通過對銅綠假單胞菌PA1株與噬菌體的相互作用，篩選出抗性菌株PA1r并做了相關研究，發現抗性菌株可以分泌紅色素，且致病性下降[6]。噬菌體抗性菌株致病性的下降已被多項研究所證實[4,16]，本研究經腹腔注射敏感菌株小鼠的死亡率達到40%，而腹腔注射抗性菌株小鼠的死亡率為0，也證明了噬菌體抗性菌株致病性的下降。噬菌體抗性菌株致病性的下降會導致細菌在動物體內更容易被免疫系統清除。
本研究發現，噬菌體抗性菌株的耐藥性發生了改變，其對替米考星、環丙沙星、氨曲南、妥布霉素的抑菌圈直徑增大，比噬菌體敏感菌株的耐藥性降低，該結果與Jalasvuori報道的結果類似[17]。噬菌體抗性菌株耐藥性的下降會導致其在較低的抗生素濃度下即可被殺死。
噬菌體抗性菌株產生的幾率大約為千萬分之一。細菌對噬菌體的抗性是相對的，其對一株噬菌體產生抗性，但還可以被其他的噬菌體感染。于玲等分離到對大腸桿菌具有抗性的噬菌體，并將其與原噬菌體混合制成新的噬菌體雞尾酒用于殺菌，結果表明，該噬菌體雞尾酒不僅具有明顯的殺菌效果，而且在體外降低了噬菌體抗性菌株的產生和突變頻率[18]。
噬菌體抗性突變菌株的產生是細菌和噬菌體相互作用的結果，抗性菌株的產生必然會導致細菌基因組及表型的變化。本研究通過分析大腸桿菌短尾噬菌體Bp4的抗性菌株和敏感菌株，發現抗性菌株的耐藥性和致病性均下降，說明噬菌體抗性菌株的產生不會對噬菌體治療效果產生較多副作用，也為噬菌體治療中出現抗性菌問題的解決提供了參考依據。
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