10種有機(jī)物對氧化亞鐵硫桿菌BYM磁小體生長、合成、發(fā)酵、產(chǎn)量的影響（二）
2、結(jié)果與分析
2.1不同有機(jī)物對Acidithiobacillus ferrooxidans BYM生長的影響
本研究通過改變培養(yǎng)基中添加有機(jī)物的濃度，探究不同有機(jī)物的不同濃度對A.ferrooxidans BYM生長的影響。
2.1.1亞鐵氧化速率的比較
圖1不同濃度不同小分子有機(jī)酸對Acidithiobacillus ferrooxidans BYM亞鐵氧化速率影響A：l-抗壞血酸.B：蘋果酸.C：葡萄糖酸.**表示P<0.01
在探究不同有機(jī)物的不同濃度對A.ferrooxidans BYM生長的影響試驗(yàn)中，l-抗壞血酸、蘋果酸以及葡萄糖酸的添加可促進(jìn)A.ferrooxidans BYM的亞鐵氧化。如圖1所示，隨著l-抗壞血酸(圖1A)和蘋果酸(圖1B)濃度的增加，A.ferrooxidans BYM亞鐵氧化速率總體呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，2 mmol/L l-抗壞血酸添加組與5 mmol/L蘋果酸添加組的亞鐵氧化速率顯著高于未添加有機(jī)物組，表明2 mmol/L l-抗壞血酸與5 mmol/L蘋果酸對A.ferrooxidans BYM亞鐵氧化速率具有促進(jìn)作用。隨著葡萄糖酸(圖1C)濃度的增加，其亞鐵氧化速率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。5 mmol/L和20 mmol/L葡萄糖酸添加組的亞鐵氧化速率均顯著高于未添加有機(jī)物組，表明5 mmol/L和20 mmol/L葡萄糖酸對A.ferrooxidans BYM亞鐵氧化速率具有促進(jìn)作用。其中，2、8、10 mmol/L的l-抗壞血酸添加組相較于未添加有機(jī)物組存在極顯著差異(P<0.01)，5、10、20、30 mmol/L的蘋果酸添加組相較于未添加有機(jī)物組存在極顯著差異(P<0.01)，5、20、30、40 mmol/L的葡萄糖酸添加組相較于未添加有機(jī)物組存在極顯著差異(P<0.01)。
圖2不同濃度不同有機(jī)物對Acidithiobacillus ferrooxidans BYM亞鐵氧化速率影響A：檸檬酸.B：酒石酸.C：TritonX-100.D：吐溫-80.E：SDS.F：甘氨酸.G：EDTA-2Na.**表示P<0.01
如圖2所示，添加不同濃度檸檬酸、酒石酸、TritonX-100、吐溫-80和SDS，隨著有機(jī)物濃度的增加，A.ferrooxidans BYM亞鐵氧化速率均整體呈現(xiàn)下降趨勢。檸檬酸添加組(圖2A)、酒石酸添加組(圖2B)、TritonX-100添加組(圖2C)和SDS添加組(圖2E)相較于未添加有機(jī)物組均存在極顯著差異(P<0.01)。0.5、4、8 mmol/L吐溫-80添加組(圖2D)相較于未添加有機(jī)物組均存在極顯著差異(P<0.01)。說明檸檬酸、酒石酸、TritonX-100、吐溫-80和SDS的存在均會影響A.ferrooxidans BYM亞鐵氧化速率，抑制菌體的生長。
如圖2所示，根據(jù)甘氨酸和EDTA-2Na試驗(yàn)可知，隨著甘氨酸濃度的增加，其亞鐵氧化速率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(圖2F)。增加EDTA-2Na濃度，其亞鐵氧化速率呈現(xiàn)先降低然后趨于平穩(wěn)的趨勢(圖2G)。甘氨酸添加組與EDTA-2Na添加組相較于未添加有機(jī)物組均存在極顯著差異(P<0.01)。由此可說明，上述有機(jī)物的添加均會抑制A.ferrooxidans BYM的亞鐵氧化能力。
綜上所述，l-抗壞血酸濃度為2 mmol/L、蘋果酸濃度為5 mmol/L、葡萄糖酸為5 mmol/L和20 mmol/L時均會促進(jìn)A.ferrooxidans BYM的亞鐵氧化速率，分別可達(dá)到1.55×10?6、1.70×10?6、1.42×10?6和1.47×10?6 mol/h。然而，其他有機(jī)物的添加均對A.ferrooxidans BYM亞鐵氧化產(chǎn)生抑制作用。因此，選擇l-抗壞血酸、蘋果酸和葡萄糖酸進(jìn)行下一步試驗(yàn)。
為進(jìn)一步篩選磁小體合成最優(yōu)促進(jìn)劑，選用l-抗壞血酸(0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L)、蘋果酸(0、0.5、1.0、3.0、5.0 mmol/L)和葡萄糖酸(0、5、10、15、20 mmol/L)進(jìn)行試驗(yàn)，以A.ferrooxidans BYM達(dá)到對數(shù)期的亞鐵氧化速率、菌體濕重和磁小體產(chǎn)量作為篩選標(biāo)準(zhǔn)(圖3)。
圖3不同有機(jī)酸對Acidithiobacillus ferrooxidans BYM亞鐵氧化速率影響A：l-抗壞血酸.B：蘋果酸.C：葡萄糖酸.**表示P<0.01
如圖3所示，1.0 mmol/L l-抗壞血酸對A.ferrooxidans BYM菌體生長的促進(jìn)作用最顯著(圖3A)，其亞鐵氧化速率可達(dá)2.17×10?6 mol/h。1.0 mmol/L的蘋果酸對A.ferrooxidans BYM菌體生長的促進(jìn)作用最明顯，其亞鐵氧化速率高于l-抗壞血酸，可達(dá)2.40×10?6 mol/h(圖3B)。葡萄糖酸濃度為20 mmol/L時，對A.ferrooxidans BYM菌體生長的促進(jìn)作用最明顯，其亞鐵氧化速率最高，可達(dá)2.42×10?6 mol/h(圖3C)。0.5、1.0、1.5 mmol/L l-抗壞血酸添加組相較于未添加有機(jī)物組均存在極顯著差異(P<0.01)，0.5 mmol/L和1.0 mmol/L蘋果酸添加組相較于未添加有機(jī)物組均存在極顯著差異(P<0.01)，10、15、20 mmol/L葡萄糖酸添加組相較于未添加有機(jī)物組均存在極顯著差異(P<0.01)。
2.1.2菌體生長的比較
如圖4所示，l-抗壞血酸以1.5 mmol/L添加時，其菌體濃度高于未添加組，可達(dá)0.160 g/L(圖4A)，相較于未添加組存在極顯著差異(P<0.01)。
其中，0.5 mmol/L l-抗壞血酸試驗(yàn)組菌體濕重較低，相較于未添加組存在極顯著差異(P<0.01)。蘋果酸濃度在1 mmol/L時，其菌體濃度略高于未添加有機(jī)物組，此時菌體濃度最高，可達(dá)0.145 g/L(圖4B)。其中，3 mmol/L和5 mmol/L蘋果酸試驗(yàn)組相較于未添加有機(jī)物組存在極顯著差異(P<0.01)。當(dāng)葡萄糖酸添加量為15 mmol/L，其菌體濃度最高，可達(dá)0.188 g/L(圖4C)。其中，添加10 mmol/L葡萄糖酸試驗(yàn)組相較于未添加有機(jī)物組存在顯著差異(P<0.05)，添加15 mmol/L和20 mmol/L葡萄糖酸試驗(yàn)組相較于未添加有機(jī)物組存在極顯著差異(P<0.01)。
圖4不同濃度有機(jī)物對Acidithiobacillus ferrooxidans BYM菌體濃度的影響A：l-抗壞血酸.B：蘋果酸.C：葡萄糖酸.**表示P<0.01，*表示P<0.05
2.2不同有機(jī)物對Acidithiobacillus ferrooxidans BYM磁小體合成的影響
如圖5所示，磁小體提取試驗(yàn)表明，1.0、1.5、2.0 mmol/L l-抗壞血酸添加組磁小體產(chǎn)量均高于未添加有機(jī)物組。1.5 mmol/L l-抗壞血酸添加組磁小體產(chǎn)量最高，為9.83×10?4 g/L(圖5A)。1.0、1.5、2.0 mmol/L l-抗壞血酸添加組相較于未添加有機(jī)物組均存在極顯著差異(P<0.01)。1.0 mmol/L蘋果酸添加組磁小體產(chǎn)量最高為7.58×10?4 g/L(圖5B)。0.5、1.0、3.0 mmol/L蘋果酸添加組相較于未添加有機(jī)物組均存在極顯著差異(P<0.01)。10 mmol/L葡萄糖酸添加組磁小體產(chǎn)量最高，為2.00×10?3 g/L(圖5C)。5、10、15 mmol/L葡萄糖酸添加組磁小體產(chǎn)量與未添加有機(jī)物組相比均存在極顯著差異(P<0.01)。同時，所有蘋果酸以及葡萄糖酸添加組的磁小體產(chǎn)量均高于未添加組。
圖5不同濃度有機(jī)物對Acidithiobacillus ferrooxidans BYM磁小體合成的影響A：l-抗壞血酸.B：蘋果酸.C：葡萄糖酸.**表示P<0.01
2.3葡萄糖酸對Acidithiobacillus ferrooxidans BYM生長及磁小體合成的促進(jìn)作用
根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果選擇10 mmol/L的葡萄糖酸進(jìn)行A.ferrooxidans BYM發(fā)酵培養(yǎng)，以不添加有機(jī)物的A.ferrooxidans BYM作為對照組。葡萄糖酸作用前后菌體表觀形態(tài)以及表面基團(tuán)化結(jié)果如圖6所示。SEM結(jié)果表明，添加葡萄糖酸組細(xì)菌呈橢圓形，表面光滑(圖6A)。而對照組表面有褶皺，呈桿狀(圖6B)。TEM結(jié)果表明，添加葡萄糖酸組細(xì)菌胞內(nèi)磁小體分散排列(圖6C)，數(shù)量明顯高于未添加葡萄糖酸組(圖6D)。
采用FTIR儀對添加10 mmol/L葡萄糖酸A.ferrooxidans BYM進(jìn)行測試，如圖7所示。以處于對數(shù)期的A.ferrooxidans BYM作為對照。
添加10 mmol/L葡萄糖酸組在3 402.02、2 926.84、1 652.82、1 536.74、1 236.29、1 079.29和614.31 cm?1處出現(xiàn)峰值。未添加有機(jī)物組在3 414.28、2 926.87、2 362.35、1 651.55、1 538.74、1 453.26、1 236.65、1 080.13和612.30 cm?1處出現(xiàn)峰值(圖7)。通過與NIST數(shù)據(jù)庫比較可知，經(jīng)過葡萄糖酸處理后相較于未添加葡萄糖酸組在2 362 cm?1處少了一個峰，推測可能是C10H?。
圖6 Acidithiobacillus ferrooxidans BYM的掃描電鏡圖及透射電鏡圖A：500 nm標(biāo)尺下的葡萄糖酸處理組掃描電鏡圖.B：500 nm標(biāo)尺下的對照組掃描電鏡圖.C：500 nm標(biāo)尺下的葡萄糖酸處理組透射電鏡圖.D：500 nm標(biāo)尺下的對照組透射電鏡圖.箭頭指向磁小體黑色顆粒
為探究A.ferrooxidans BYM發(fā)酵過程中菌體變化、磁小體生成以及亞鐵消耗情況，選用菌體生長動力學(xué)模型建立最常用的是Logistic模型和Monod方程。Logistic模型是一個非常典型的S型曲線方程，常被用來描述菌體濃度與營養(yǎng)物質(zhì)之間的非線性關(guān)系。因此A.ferrooxidans BYM菌體生長動力學(xué)模型選用Logistic方程進(jìn)行擬合。利用1stOpt軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合，可得動力學(xué)參數(shù)為X0=0.010 5，Xm=0.165 2，μm=0.084 3。代入公式(2)，整理可得A.ferrooxidansBYM菌體生長隨時間變化的動力學(xué)方程，見公式(5)。
式中，X代表生物量(g/L)，t代表發(fā)酵時間(h)。
由公式(5)所述動力學(xué)方程可知，隨著發(fā)酵時間的延長，菌體濕重逐漸增加，將擬合得到的參數(shù)代入方程，得到R2為0.99，擬合結(jié)果良好，說明該模型能夠很好地描述A.ferrooxidans BYM菌體生長過程。
圖7葡萄糖酸處理前后Acidithiobacillus ferrooxidans BYM的傅里葉變換紅外光譜圖
A.ferrooxidans BYM磁小體生成動力學(xué)為磁小體生物合成過程，選用Luedeking-Priet方程構(gòu)建動力學(xué)模型，此方程能夠準(zhǔn)確描述出產(chǎn)物形成同菌體生長的相關(guān)性。利用1stOpt軟件對不同發(fā)酵時間磁小體濃度進(jìn)行非線性擬合，得到動力學(xué)參數(shù)為P0=0.000 1，α=0.000 9，β=0.000 2，代入公式(3)，整理可得A.ferrooxidans BYM磁小體合成隨時間變化的動力學(xué)方程，見公式(6)。
式中，P代表磁小體生成量(g/L)，t代表發(fā)酵時間(h)。
由公式(6)所述的動力學(xué)方程可知，隨著發(fā)酵時間的延長，磁小體的產(chǎn)量逐漸增加，將擬合得到的參數(shù)代入方程，得到R2為0.98，擬合結(jié)果良好，說明該模型能夠很好地描述A.ferrooxidans BYM磁小體生成過程。
A.ferrooxidans BYM是以鐵或硫?yàn)榈孜镞M(jìn)行電子傳遞的微生物，并且僅在亞鐵存在的情況下，A.ferrooxidans BYM才能合成磁小體。因此，本研究將FeSO4作為關(guān)鍵底物進(jìn)行動力學(xué)分析。利用1stOpt軟件對不同發(fā)酵時間的亞鐵濃度進(jìn)行非線性擬合，得到A.ferrooxidans BYM亞鐵消耗動力學(xué)參數(shù)為S0=?0.995 3，a=0.029 0，b=0.000 3，代入公式(4)，整理可得A.ferrooxidans
式中，S代表亞鐵濃度(g/L)，t代表發(fā)酵時間(h)。
由公式(7)所述的動力學(xué)方程可知，隨著發(fā)酵時間逐漸接近72 h，亞鐵含量趨近于0，R2為0.98，擬合結(jié)果良好，說明該模型能夠很好地描述A.ferrooxidans BYM亞鐵利用過程。
10種有機(jī)物對氧化亞鐵硫桿菌BYM磁小體生長、合成、發(fā)酵、產(chǎn)量的影響（一）
10種有機(jī)物對氧化亞鐵硫桿菌BYM磁小體生長、合成、發(fā)酵、產(chǎn)量的影響（二）
10種有機(jī)物對氧化亞鐵硫桿菌BYM磁小體生長、合成、發(fā)酵、產(chǎn)量的影響（三）
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