生防菌株不同生長階段時發酵液色素與OD650 nm的變化
摘要：真菌GD-2和HZ-31是2株分離于雜草中的具有生防潛力的生防菌株，為進一步研究2株菌株的發酵培養及田間應用技術，進行了生防菌株生長特性研究。通過室內PAS培養基培養，裝液量為100 mL/250 mL，培養溫度（25±1）℃，培養10 d，觀察測定培養過程中發酵液顏色、菌絲干重變化、OD650 nm和pH，并利用聚類分析方法劃分生防菌株生長階段。結果表明，在培養過程中，生防菌株發酵液的顏色、菌絲干重、OD650 nm和pH都會隨著培養時間而變化。在相同的培養條件下，來源于不同寄主的生防菌菌株之間在顏色、菌絲干重變化、OD650 nm和pH變化表現出差異。2株生防菌菌株的生長分為3個階段，1～2 d為適應階段，3～5 d為對數生長階段，6～10 d為穩定階段。生防菌株在培養過程的發酵液色素變化和OD650 nm的變化可作為生防菌株培養的表征性特征。
真菌在生長、產孢、萌發時對營養和環境條件都有其基本的和特殊的需求，了解真菌生長、產孢和萌發的具體特性和要求，對植物真菌病害的研究具有重要意義。不同真菌在不同地區的分布又有所不同，這種差異反映了生防菌對生長環境的選擇，表現在其對不同環境利用的生長特性上。在特定的培養條件下，真菌發酵液的顏色、菌絲干重、發酵液吸光度和pH等的變化，都能反映真菌的生長特性。針對篩選出的具有良好生防潛力的2株真菌，研究生長特性，了解適宜培養條件，對進一步研究該菌株的生物防治應用具有重要意義。菌株GD-2和HZ-31是青海省農業有害生物綜合治理重點實驗室篩選出的對野燕麥具有防除效果的生防菌株[1，2]，本研究對該生防菌株的生長特性進行了研究，有助于了解其培養特性的差異，尋找培養過程的異質性指標，為進一步的生物學研究發酵生產、制劑研制及田間應用等奠定基礎。
1材料及方法
1.1試驗材料
菌株：供試菌株及來源見表1。
培養基：固體培養基為PDA培養基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL）；液體培養基為PSA培養基（馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，水1 000 mL）。
1.2試驗方法
生防菌株培養：將生防菌在PDA平板上培養7 d，打取3個6 mm的菌片，置于盛有100 mL PSA液體培養基的250 mL三角瓶中培養，培養溫度為（25±1）℃，搖床轉速為110 r/min，每天取3瓶，過濾菌絲，收集發酵液。
觀察測定：①觀察生防菌株生長過程發酵液顏色的變化。②測定生防菌株生長過程菌絲干重的變化。收集發酵液在5 000 r/min離心15 min，倒掉上清液后菌體用去離子水洗滌，離心，反復3次后放到50℃的烘箱中烘至恒重，在分析天平上準確稱重。③測定生防菌株生長過程OD650 nm的變化。將發酵液5 000 r/min離心，取上清液，用UV751GD型分光光度計（上海精科）測定OD650 nm。④測定生防菌株生長過程中pH的變化，分析生防菌株的生長特性。
分析生防菌株的生長階段，以生防菌株培養時間為分類，以菌株GD-2和HZ-31的菌絲干重、OD650 nm、pH為指標，構建矩陣。以歐氏距離為相關尺度，用類平均法進行聚類分析。
1.3統計分析
采用Eecel軟件作圖，DPS軟件進行數據分析。
2結果與分析
2.1生防菌株生長過程發酵液顏色的變化
2株生防菌株在培養過程顏色變化不同。發酵液顏色會發生階段性變化，在發酵初期（1～3 d），生防菌菌株GD-2和HZ-31的發酵液顏色與培養基配制時的顏色相同，沒有明顯的變化。在發酵中期（4～6 d），2株菌株發酵液的顏色發生明顯變化，菌株GD-2發酵液在4 d時變為奶黃色，在6 d時顏色加深，轉變為黃褐色；而菌株HZ-31發酵液在4 d時則變為淡黃色，在6 d時顏色加深轉變為深黃色。在發酵后期（7 d以后），2株生防菌發酵液保持發酵6 d時的顏色，沒有明顯變化。
2.2生防菌株生長過程中菌絲干重的變化
菌株GD-2和菌株HZ-31培養過程中菌絲干重的變化趨勢相差較大，2株菌株的菌絲干重增加量情況存在較大差異（圖1）。菌株GD-2菌絲干重增加量最大的時間為5～8 d，8 d時的菌絲干重達到最大值（499.8 mg/100 mL），隨后的變化趨于平緩。而菌株HZ-31增加量最大的時間為1～4 d；4 d時的菌絲干重達到最大值，為834.4 mg/100 mL，隨后菌絲干重急劇下降。在培養初期菌株HZ-31的生長速度快于GD-2菌株，到培養后期HZ-31菌絲干重明顯低于GD-2菌株菌絲干重，2株菌株的菌絲干重的變化出現明顯差異，這可能與菌株的生物學特性和對培養基的適應性有關。
2.3生防菌株生長過程中OD650 nm的變化
由吸光度得到的生長曲線可以認為是微生物生長狀況的宏觀表現。通過測定不同培養時間的OD650 nm，可大體劃分微生物生長的不同生長時期，為批量生產提供依據。菌株GD-2和菌株HZ-31發酵過程中發酵液離心上清液的OD650 nm變化如圖2。2株菌株發酵過程中變化趨勢基本類似，隨著發酵進程OD650 nm逐漸增高，在發酵中期出現最高峰值，但是不同的菌株出現峰值的時間不同。GD-2菌株出現2個峰值，在3 d和5 d分別為0.103和0.114，之后OD650 nm變化幅度較大，8 d時達到最低峰（0.027）；而HZ-31變化較緩慢，7 d時達到最低峰（0.027）。
2.4生防菌株生長過程中pH的變化
菌株GD-2和菌株HZ-31發酵過程中pH的變化趨勢相差較大（圖3）。菌株GD-2培養初期（1～3 d），pH為6.50～6.19，培養中期（4～6 d），pH為5.78～5.87，此時pH上升很快，培養后期（7～10 d），pH為6.02～8.34，變化最快，在培養的2～5 d，pH有所下降。菌株HZ-31從培養初期的6.23逐漸升高為培養后期的9.08～9.04，在4 d時略有波動，從5 d開始，pH的變化趨于平緩。結果表明，2株菌株發酵液的pH從最初的6.2左右逐漸升高8.34和9.04，培養過程中2株菌株pH變化過程差異較大。
2.5生防菌株生長階段聚類分析
用聚類分析方法對培養時間進行歸類。以培養時間為分類，以菌株GD-2和HZ-31的菌絲干重、OD650 nm、pH為指標，構建矩陣，用歐氏距離為相關尺度，以類平均法進行系統聚類，聚類過程見表2。培養時間對菌絲干重、OD650 nm、pH影響見圖4。分析結果表明，當λ=81.5時，可將生防菌菌株的生長分為3個階段，第一個階段為適應期，培養時間為1～2 d，菌株的菌絲干重、OD650 nm、pH變化較小，菌株生長處于適應階段。第二階段為對數期，培養時間為3～5 d，菌株的菌絲干重、OD650 nm、pH變化較大，菌株處于對數生長階段。第三階段為穩定期，培養時間為6～10 d，菌株的菌絲干重、OD650 nm、pH變化平緩，菌株生長處于穩定階段。
3小結與討論
2株生防菌株在培養過程中，發酵液的顏色、菌絲干重、OD650 nm和pH都會隨著培養時間而變化。在相同的培養條件下，來源于不同寄主的2株生防菌株在培養過程中培養液顏色不同，同一菌株生長過程中發酵液顏色會發生階段性變化，與其生理特性有關，也是菌株培養特征之一。2株菌株培養過程中OD650 nm隨培養進程的變化而變化，在發酵期間出現峰值，而且峰值出現的時間不同。OD650 nm為生防菌株生長過程中的生理變化特征之一。生防菌株在培養過程中色素變化和OD650 nm的變化可作為生防菌株培養的表征性特征。這些性狀的變化與生防菌的萌發、侵染以及傳播等生物學特性的關系有待于進一步的研究。
2株生防菌株培養過程中pH增高，從最初6左右升高到后期的8.34和9.04，2株生防菌株培養程中pH變化差異較大。2株生防菌株在培養過程中，菌絲干重隨時間變化而變化，菌絲干重增加量最大的時間分別為2～4 d和5～8 d，而且菌絲干重增加的量存在較大差異。
在培養溫度（25±1）℃條件下，HZ-31菌株在培養時間4 d時，菌絲干重最大，為834.4 mg/100 mL，pH為7.71；GD-2菌株在培養到8 d時菌絲干重達到最大值，為499.8 mg/100 mL，pH為7.38，說明2株生防菌株對pH有一定的選擇性，表現為均偏好偏堿性的生長條件。
采用PSA液體培養基在（25±1）℃的條件下，來自野燕麥的GD-2菌株的生長分為3個階段：1～2 d為適應階段，菌株的菌絲干重、OD650 nm、pH變化較小；3～5 d為對數生長階段，菌株的菌絲干重、OD650 nm、pH變化大；6～10 d為穩定階段，菌株的菌絲干重、OD650 nm、pH變化平緩。而菌株HZ-31的前期生長速度高于GD-2菌株，對數生長期提前到來，這可能與菌株的生物學特性和對培養基的適應性有關，這與前人研究結果基本一致[3-6]，因此，在進行生防菌的發酵培養過程中，需注意在對數生長階段的營養供給和培養條件的控制。
研究2株生防菌株的生長特性，對生防菌株的發酵培養具有較好的指導作用，在實際的發酵培養基配方及田間應用方面，還存在著復雜的影響因素，需要進一步研究。