微生物生長動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)的應用：研究β-內酰胺類抗生素對絲狀化的誘導能力
研究背景：β-內酰胺類抗生素能夠改變細菌細胞壁的形狀，導致細菌絲狀化或球形化。絲狀化發(fā)生在細胞分裂被阻斷但生長繼續(xù)進行時，形成長度可達其桿狀細胞50倍的絲狀細菌。絲狀形態(tài)提供了生存優(yōu)勢，如抑制免疫細胞的吞噬作用、促進在宿主組織內的生存，并減少對某些抗菌劑的敏感性。然而，絲狀化并不能直接與抗生素敏感性或抗藥性相關聯(lián)，但在早期AST中是關鍵知識。β-內酰胺類抗菌藥物被廣泛用于治療感染；然而β-內酰胺類耐藥性令人擔憂的蔓延在全球范圍內越來越多地被報道，并代表著一個重大的健康問題。腸桿菌科細菌對青霉素類和頭孢菌素最重要的耐藥機制是廣譜β-內酰胺酶（ESBL）。在本研究中，研究人員提出了一種圖像分析算法，可量化細菌的長度，從而量化細菌形態(tài)的變化。這在檢測青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類和單內酰胺類等抗生素時尤為重要。眾所周知，β-內酰胺類抗生素可誘導細菌發(fā)生形態(tài)學變化（如絲狀或球形體形成）。因此，快速檢測這些變化可能具有重要的臨床意義。β-內酰胺類抗生素能夠改變細菌細胞壁的形狀，導致細菌絲狀化或球形化。絲狀化發(fā)生在細胞分裂被阻斷但生長繼續(xù)進行時，形成長度可達其桿狀細胞50倍的絲狀細菌。
絲狀形態(tài)提供了生存優(yōu)勢，如抑制免疫細胞的吞噬作用、促進在宿主組織內的生存，并減少對某些抗菌劑的敏感性。然而，絲狀化并不能直接與抗生素敏感性或抗藥性相關聯(lián)，但在早期AST中是關鍵知識。β-內酰胺類抗菌藥物被廣泛用于治療感染；然而β-內酰胺類耐藥性令人擔憂的蔓延在全球范圍內越來越多地被報道，并代表著一個重大的健康問題。
腸桿菌科細菌對青霉素類和頭孢菌素最重要的耐藥機制是廣譜β-內酰胺酶（ESBL）。在本研究中，研究人員提出了一種圖像分析算法，可量化細菌的長度，從而量化細菌形態(tài)的變化。這在檢測青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類和單內酰胺類等抗生素時尤為重要。眾所周知，β-內酰胺類抗生素可誘導細菌發(fā)生形態(tài)學變化（如絲狀或球形體形成）。因此，快速檢測這些變化可能具有重要的臨床意義。
oCelloScope微生物生長動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)的應用
丹麥BioSense推出的微生物生長動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)（oCelloScope）能自動測量微生物的生長動力學與形態(tài)學，同步給出微生物生長早期階段的生長曲線和形態(tài)學動態(tài)變化。oCelloScope是一種數字延時顯微鏡技術，可掃描流體樣品，生成一系列圖像，使用oCelloScope系統(tǒng)進行時間推移顯微成像，每15分鐘掃描一次，持續(xù)12小時。使用自定義的MATLAB腳本進行圖像處理和分析。oCelloScope系統(tǒng)有能通過頭孢菌素與β-內酰胺酶抑制劑的組合，快速確定產β-內酰胺酶細菌（如ESBL產菌）的表型。頭孢菌素與β-內酰胺酶抑制劑聯(lián)合產生超廣譜β-內酰胺酶。
實驗結論
本文提出了一種自動化的基于圖像的算法，能夠檢測抗生素誘導的絲狀化。這種方法有助于提高AST的準確性，消除自動系統(tǒng)中的誤判。通過快速準確地檢測絲狀化和抗藥性，oCelloScope系統(tǒng)可以作為早期預測抗藥性細菌的工具。使用三種不同抗藥性和絲狀化動力學的E.coli菌株，研究了一種新型圖像分析算法，以量化細菌長度和絲狀化。研究了12種β-內酰胺抗生素或β-內酰胺酶抑制劑組合對絲狀化的誘導能力。絲狀化在大約120分鐘時達到峰值，平均細胞長度為30微米。
圖1、光鏡下抗生素誘導大腸桿菌成絲。頭孢噻肟(8mg/L)處理后的大腸桿菌ATCC259222的抗生素誘導成絲，光鏡下10倍(a)和100倍(b)放大。
圖2、哌拉西林對oCelloScope系統(tǒng)獲得的大腸桿菌生長和長度的影響。a)采用兩種不同的算法對未經處理(點線)和頭孢噻肟處理(實線)的大腸桿菌進行細菌生長動力學和成絲的定量測定:生長動力學(藍色圖)是基于分割和提取表面積測量的，細菌長度(綠色圖)是基于分割提取的平均長度測量的。8 mg/L頭孢噻肟處理后，oCelloScope系統(tǒng)分別在(b)60 min、(c)120 min、(d)180 min和(e)240 min時獲得大腸桿菌的形態(tài)學圖像。
圖3、β-內酰胺-β-內酰胺酶抑制劑聯(lián)合應用于抗生素誘導產esbl大腸桿菌成絲的早期檢測。哌拉西林/他唑巴坦(32/4 mg/L)(a-b)或替卡西林/克拉維酸(32/2 mg/L)(c-d)處理大腸桿菌的生長動力學和平均細菌長度。哌拉西林/他唑巴坦誘導的微絲(長度增加>5μm)可在30 min內檢測到，而替卡西林/克拉維酸誘導的微絲缺失可在40 min內檢測到。
圖4、β-內酰胺-β-內酰胺酶抑制劑組合對大腸桿菌生長動力學的影響。對照菌株大腸桿菌、產esbl大腸桿菌和血培養(yǎng)大腸桿菌分別用4種不同濃度的哌拉西林單獨(a-c)或補充他唑巴坦(d-f)和噻卡西林單獨(g-i)或補充克拉維酸(j-1)處理。每隔15 min重復測定生長動力學，持續(xù)10 h。
圖5、β-內酰胺-β-內酰胺酶抑制劑組合對大腸桿菌細菌長度的影響。對照菌株大腸桿菌、產esbl大腸桿菌和血培養(yǎng)大腸桿菌分別用4種不同濃度的哌拉西林單獨(a-c)或補充他唑巴坦(d-f)和噻卡西林單獨(g-i)或補充克拉維酸(j-1)處理。每15 min重復測量細菌長度，持續(xù)10 h。
總結
β-內酰胺類抗生素能夠改變細菌細胞壁的形狀，如形成絲狀或球形細胞。在依靠比色法或濁度法（如Vitek2、Phoenix、MicroScan WalkAway）的系統(tǒng)中，細菌的絲狀化可能會被誤認為是生長，從而使抗菌藥敏感性的早期測定變得復雜。本論文研究的目的是利用三維數碼顯微成像系統(tǒng)oCelloScope，研究一種量化絲狀細菌的自動圖像分析算法。利用三種耐藥性不同且絲狀化動力學不同的大腸桿菌菌株，研究了一種量化細菌長度和細菌絲狀化的新型圖像分析算法。共分析了12種β-內酰胺類抗生素或β-內酰胺酶抑制劑組合誘導菌絲生長的能力。絲狀化在大約120分鐘時達到頂峰，細胞平均長度為30μm。自動圖像分析算法顯示了快速檢測和量化大腸桿菌中β-內酰胺誘導的絲狀化的明顯能力。這種快速測定β-內酰胺介導的形態(tài)學改變的方法可促進未來快速、準確AST系統(tǒng)的開發(fā)，進而實現早期靶向抗菌治療。因此快速檢測β-內酰胺介導的形態(tài)學變化可能具有重要的臨床意義。