單一外源微生物的生長繁殖情況研究——誘變菌B38的生長曲線繪制
為實現(xiàn)對土壤修復(fù)過程中所加入的單一外源微生物的生長繁殖情況進行跟蹤監(jiān)測的目的，本論文創(chuàng)新性的引入熒光示蹤技術(shù)。使用熒光染料DAPI對誘變菌的DNA 進行標(biāo)記，與微生物載體諾沃肥復(fù)合后，接種于受污染土壤。通過篩選DAPI 染料的使用濃度與菌懸液的稀釋比例，采用熒光計數(shù)技術(shù)，成功的實現(xiàn)對外源微生物在土壤中的生長繁殖情況的跟蹤研究。為外源微生物生長繁殖的定量化研究提供了一種簡便、快捷的方法，保證生物強化修復(fù)技術(shù)的順利實施。
培養(yǎng)基及溶液的配制
使用液體牛肉膏~蛋白胨培養(yǎng)基對活性菌株B38進行培養(yǎng)。培養(yǎng)基的配制方法為：準(zhǔn)確稱取蛋白胨 10g/L,氯化鈉 5g/L,牛肉膏5g/L,用 1mol/L的鹽酸和 1mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié) pH=7.2,于121℃高壓蒸汽滅菌30min備用。
0.85 %（M/V）生理鹽水的配制：準(zhǔn)確稱取0.85g氯化鈉，溶解后用蒸餾水稀釋至 100mL，于121℃下高壓滅菌30min備用。
DAPI 儲備液的配制：用雙蒸水將 DAPI 粉末配制成 1.0×103μg/mL的儲備液，于~20℃保存?zhèn)溆谩?
DAPI工作液的配制：用磷酸鹽緩沖溶液（PBS,pH=7.4）分別稀釋儲備液至 10μg/mL、0.1μg/mL,制得DAPI工作液，于4℃保存?zhèn)溆谩?
菌種的培養(yǎng)及生長曲線的測定
本實驗中用到的誘變菌種 B38為實驗室前期以枯草芽孢桿菌為初始菌種，通過紫外誘變5min得到的高效鎘耐受性的誘變菌種。出發(fā)菌枯草芽孢桿菌購買自國家普通微生物菌種保藏管理中心（CCGMC）。出發(fā)菌株對鎘有一定的抗性，其最小抑制濃度（MIC）為 0.25mmol/L,而選育出的 B38菌種，其抗鎘性能大大提高，MIC達到了3mmol/L.
將B38菌體接種于5mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于37℃，150r/min活化培養(yǎng)10h至對數(shù)生長期中段；之后取 1mL菌懸液接種于 100mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，于37℃，150r/min擴大培養(yǎng)。每隔 2h,利用紫外可見分光光度計測定菌懸液的OD600值，并同時對菌懸液進行顯微計數(shù)，測定B38的生長曲線。每組實驗設(shè)置3個平行。
結(jié)果
圖1 B38菌種的生長曲線
誘變菌B38的生長曲線如圖1所示。B38的生長繁殖分為4個階段：調(diào)整期（1）、對數(shù)期（2）、穩(wěn)定期（3）和衰亡期（4）。B38在 2h左右進入對數(shù)生長期，此階段菌體快速生長，生物量迅速增加；12h后，菌體進入穩(wěn)定期，活菌數(shù)曲線和渾濁度曲線同時達到峰值。處于對數(shù)生長期中后段的菌株具有較高的生理活性，因此，選擇培養(yǎng)時間為10h,即培養(yǎng)至對數(shù)生長期中后段的菌懸液進行后續(xù)實驗。
將12h以內(nèi)的活菌數(shù)與菌懸液的OD600值進行線性回歸，擬合結(jié)果見圖 2.從接種期至對數(shù)生長期結(jié)束，活菌數(shù)與菌懸液的 OD600值之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系（r2=0.9766），因而在后續(xù)培養(yǎng)實驗中，采用測定對數(shù)生長期B38菌懸液OD600值的方法，通過線性回歸計算對細菌數(shù)量進行計數(shù)，這一發(fā)現(xiàn)可顯著提高實驗效率。
結(jié)論
為研究土壤中施加外源微生物B38后，其菌體濃度隨時間的變化情況，本文創(chuàng)新性的引入了DAPI熒光染色技術(shù)標(biāo)記微生物的DNA分子進行顯微熒光示蹤計數(shù)研究。選擇不同濃度梯度的染料進行對比，結(jié)果顯示使用高濃度的工作液鏡檢下熒光反應(yīng)過強，無法識別單個菌體，最終選擇0.1μg/mL的DAPI為最適濃度。
為能夠?qū)w數(shù)進行準(zhǔn)確計數(shù)，選擇不同稀釋倍數(shù)進行鏡檢。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)菌懸液稀釋 106倍后，菌體分散度高、數(shù)量適中，可實現(xiàn)計數(shù)。使用熒光顯微計數(shù)得到的 B38 菌體濃度為（3.21± 0.22）×108cells/mL,使用OD600值換算得到的濃度為（4.92±0.15）×108cells/mL,二者達到高度一致，因此熒光染色顯微計數(shù)方法準(zhǔn)確可行。
將標(biāo)記后的B38加入土壤中，傳代培養(yǎng)10h后，提取土壤微生物懸液對B38菌體進行熒光計數(shù)，所得菌體濃度為（5.58±0.13）×108cells/mL,符合B38的生長曲線。因此經(jīng)過標(biāo)記的外源微生物的熒光特性在傳代過程中得到了良好的保持。
在60d的時間內(nèi)跟蹤外源微生物B38在實際土壤修復(fù)過程中的數(shù)量變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)B38對惡劣的環(huán)境有較高的適應(yīng)性和發(fā)展?jié)摿Γ辉谔砑恿宋⑸镙d體后，由于載體物質(zhì)為土著微生物和外源微生物同時提供碳源、氮源及其他營養(yǎng)物質(zhì)，此時，土著微生物對B38的生長繁殖起到了部分競爭抑制作用，但是 B38菌體濃度仍達到（1.05±0.01）×1010cells/mL,與初期施加量相比，提高了近3個數(shù)量級，外源微生物得到了良好的生長繁殖。
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