雙峰駝永生化成纖維細胞系的建立方法
體外培養的細胞壽命一般較短，是影響研究穩定性的關鍵因素之一。尤其像雙峰駝，主要分布于我國甘肅、青海、新疆、內蒙古等地，對荒涼、貧瘠、嚴酷的環境有良好的適應能力，與其他動物相比有難以比擬的優越性。由于種群稀少、采樣困難、缺乏穩定的細胞資源，雙峰駝(camelus bactrianus)原代細胞傳代困難，容易衰老，相關的試驗材料及可供參考的資料也非常有限。因此，構建雙峰駝永生化細胞系十分重要。而成纖維細胞是一種生長分裂能力較強且功能旺盛的細胞，存在范圍廣、易獲取，是試驗研究中常用的細胞之一，但也同樣會面臨衰老、無法多次傳代等問題。染色體末端存在著由多條長度不同的DNA重復序列以及蛋白質組成的復合體，稱為“端粒”，它能夠維持染色體位置和結構穩定，防止染色體酶解，促進細胞正常生長。正常的體細胞染色體末端的端粒會逐漸縮短，且傳代次數有限，所以端粒對于染色體有重要的保護作用。目前，已經有很多物種成功建立起了永生化細胞系，而且方法多種多樣，通過自發永生化、過表達端粒酶逆轉錄酶(TERT,telomerase reverse transcriptase)或者病毒癌基因、突變p53和pRb基因、放射法等均可實現，其中使用最廣泛、報道最多的便是過表達hTERT。已有研究表明，在奶山羊間充質干細胞、田鼠胚胎成纖維細胞，不同物種的組織細胞中轉入hTERT，細胞能夠傳代至50～80代，并且細胞生物學特性在傳代過程中保持穩定，表明成功建立永生化細胞系。
現有技術存在的問題：由于目前還沒有雙峰駝永生化細胞系，且前人轉入hTERT成功建立細胞系，說明此法是可行的、有效的。為了解決雙峰駝研究面臨的問題，本試驗擬通過pCI-neo-hTERT質粒載體轉染Primary BCFs建立永生化細胞系，并從形態學、mRNA水平、蛋白質水平分析hTERT介導的細胞永生化，為以后開展雙峰駝的相關研究提供理論基礎。
雙峰駝永生化成纖維細胞系的建立方法，具體步驟如下：(1)原代細胞的分離培養，(2)細胞復蘇、傳代培養與凍存，(3)細胞生長的最適血清與糖濃度測定，(4)pCI-neo-hTERT載體構建和G418最佳濃度篩選及細胞轉染，(5)形態學觀察，(6)生長曲線繪制，(7)免疫熒光檢測，(8)實時熒光定量PCR檢測，(9)Western Blot檢測，(10)細胞周期檢測。
圖1為不同代次BCFs細胞形態；其中，圖1A：BCFs-P5代細胞生長形態；圖1B：BCFs-P10代細胞生長形態；圖1C：BCFs-P20代細胞生長形態；圖1D：BCFs-P30代細胞生長形態；圖1E：BCFs-P40代細胞生長形態；圖1F：BCFs-P50代細胞生長形態；圖1G：BCFs-P60代細胞生長形態；圖1H：BCFs-P70代細胞生長形態；圖1I：BCFs-P80代細胞生長形態，100×，標尺：100μm。
圖2為Primary BCFs與BCFs Cell lines的生物學特性分析；圖2A：流式細胞儀檢測BCFs-P3與BCFs-P80細胞周期分布；圖2B：流式細胞儀檢測BCFs-P3與BCFs-P80細胞G1與S期細胞占比表；圖2C：血細胞計數法繪制BCFs-P3與BCFs-P80生長曲線；圖2D：CCK-8法繪制BCFs-P3與BCFs-P80生長曲線。
雙峰駝永生化成纖維細胞系的建立和檢測結果，具體如下：
1.原代細胞形態學觀察結果
膠原酶消化法分離原代細胞，剛接種于培養瓶中，細胞還未貼壁，圓形液滴狀細胞均勻的懸浮在溶液中，形態未明，貼壁培養1h后，觀察到細胞正在進行貼壁運動，某些細胞表面部分貼壁，胞質漸漸平攤在瓶底上，折光率開始下降。培養4h后，細胞表面大部分貼壁，24h后大多數細胞完成貼壁，胞質均勻平攤，細胞形態多為長梭形、多角形、圓形等。在Primary BCFs傳代過程中發現從第BCFs-P10左右開始，與BCFs-P5相比細胞形態嚴重異常，細胞開始出現衰老和變形，并且伴隨著生長停滯、脫落、死亡等現象。
2.G418篩選結果
雙峰駝BCFs經篩選培養基篩選2周后，根據細胞的生長狀況，可以得到使所有雙峰駝BCFs死亡的最小濃度為400ng/μL，最終篩選陽性克隆時應將濃度提高50ng/μL。因此，450ng/μL可作為Primary BCFs G418篩選陽性細胞的最佳濃度。
3.pCI-neo-hTERT質粒的獲得與鑒定結果
試驗所用pCI-neo-hTERT質粒經加入酶切位點后得到質粒，質粒提取試劑盒提取純化后，使用超微量紫外分光光度計檢測得到OD260/OD280為1.838，質粒濃度為673.5ng/μL，說明所提取的質粒純度較高，沒有明顯的蛋白質、RNA、酚類物質、胍鹽等污染，滿足后續細胞轉染需要。質粒經雙酶切鑒定。
4細胞生長最適血清與糖濃度確定
CCK-8法檢測細胞生長對血清及糖濃度的依賴性，結果：BCFs-P3與BCFs-P80對血清的依賴性相似。試驗中發現BCFs-P3與BCFs-P80皆不能在無血清的環境中生長，在無血清條件下培養24h即有細胞脫落、死亡。5％FBS、10％FBS、15％FBS均可明顯提高Primary BCFs與BCFs Cell lines的分裂能力(P＆lt;0.05)。說明Primary BCFs與BCFsCell lines均具有血清依賴性，血清是促進細胞生長分裂的重要因素之一，且10％FBS為該細胞培養的最佳血清濃度。以同樣的方法檢測了培養基中葡萄糖濃度對細胞生長的影響，結果：BCFs-P3與BCFs-P80對培養基中糖濃度的依賴性一致，與4.5g/L相比，0g/L、2g/L和9g/L糖濃度條件下細胞增殖能力顯著下降(P＆lt;0.01)，說明BCFs-P3與BCFs-P80在過低或過高糖濃度的環境下細胞分裂均會受到阻礙，促進細胞生長的培養基最適糖濃度為4.5g/L。
5細胞形態學觀察結果
在永生化細胞系的建立過程中，利用德國ZEISS倒置顯微鏡成像系統記錄了形態良好、具有典型成纖維細胞特征的雙峰駝Primary BCFs與BCFs Cell lines。如圖1A：BCFs-P5代細胞生長形態；圖1B為BCFs-P10代細胞生長形態；圖1C為BCFs-P20代細胞生長形態；圖1D為BCFs-P30代細胞生長形態；圖1E：BCFs-P40代細胞生長形態；圖1F為BCFs-P50代細胞生長形態；圖1G為BCFs-P60代細胞生長形態；圖1H為BCFs-P70代細胞生長形態；圖1I為BCFs-P80代細胞生長形態。Primary BCFs傳代到第10代左右，細胞形態開始出現異常，逐漸變得細長、活力下降，并且伴隨著貼壁能力減弱、生長停滯等細胞衰老的現象。在不斷轉染hTERT質粒后細胞形態逐漸開始穩定，細胞死亡率下降，由此可以推測轉染hTERT質粒后已初步構建雙峰駝永生化細胞系。
6.實時熒光定量PCR、免疫熒光及Western Blot鑒定Primary BCFs與BCFs Celllines
波形蛋白(vimentin,VIM)是成纖維細胞的特異性標志物之一，是中間絲蛋白的其中一種，通過細胞免疫熒光染色來檢測成纖維細胞特性，在熒光顯微鏡下顯示BCFs-P3與BCFs-P80大多數胞質呈綠色(黑白圖為較亮處)熒光，細胞核DAPI染色呈藍色(黑白圖為較亮處)，波形蛋白染色為陽性。細胞界限清晰，大小均一，表現出成纖維細胞特性。而角蛋白18(CK18)是上皮細胞特異性標志物之一，VIM和CK18實時熒光定量PCR鑒定結果，以MAC-T上皮細胞為陽性對照，Primary BCFs與BCFs Cell lines各代次VIM相對表達量較高，而CK18的相對表達量較低。表明Primary BCFs細胞仍為混合細胞，存在上皮樣細胞，但經轉染hTERT以及G418篩選后BCFs Cell lines各代次純度越來越高，BCFs Cell lines大部分為成纖維細胞。Western Blot結果與實時熒光定量PCR結果一致，表明BCFs Cell lines為成纖維細胞。
7.Primary BCFs與BCFs Cell lines的生物學特性分析及外源性hTERT的整合與表達
分別利用CCK-8法與血細胞計數法對Primary BCFs與BCFs Cell lines進行活力測定。從圖2C、D可知，雙峰駝BCFs-P3與BCFs-P80的生長曲線均呈“S”型，在培養1～2d時，細胞數量沒有太大的變化，此時的細胞處于潛伏期；培養了3d后細胞開始快速生長，此時進入對數生長期；培養6d時，細胞分裂能力減弱，生長速度減緩；培養7～8d時，細胞數量基本維持不變，此時細胞生長進入了平臺期。BCFs傳至10代左右時，其分裂能力開始下降，表明了BCFs經過多次傳代后細胞逐漸出現了衰老、變形等問題。流式細胞術檢測細胞生長周期結果如圖2A和表B所示：BCFs-P3處于G1期的細胞比例為82.95％a，處于S期的細胞為8.12％b；BCFs-P80處于G1期的細胞比例為50.46％a，S期的細胞為39.83％b，且差異顯著(P＆lt;0.05)。該結果表明：BCFs-P80在G1期的生長停滯比例顯著低于BCFs-P3，且BCFs-P80在S期的細胞占比顯著高于BCFs-P3，再結合BCFs-P3與BCFs-P80的生長曲線可以證明BCFs Cell lines細胞分裂增殖能力更強，增殖速度更快，BCFs Cell lines并不受S期阻滯，增值活力旺盛。