甘露聚糖對S.cerevisiae酵母菌株生長及抗氧化活性的影響（二）
2結果與分析
2.1甘露聚糖對釀酒酵母菌株生物量和活力的影響
由圖1可知，與對照相比，甘露聚糖有效延長了酒精發酵過程中S.cerevisiae菌株的對數生長期和穩定期。隨著甘露聚糖濃度的增加，S.cerevisiae菌株生長越快，當質量濃度大于300 mg/L時，促進作用較MP3處理組降低。
圖1甘露聚糖對釀酒酵母菌株生物量的影響
由圖2可知，MP3處理組比對照組顯著增加了酵母活力(P<0.05)，尤其使酒精發酵前期和中期的葡萄糖誘發質子流(glucose induced proton electric，GIPE)值增加了8.2%和10.1%；MP1和MP2處理組，對不同酒精發酵時期酵母菌株活力無顯著差異(P>0.05)；MP4和MP5處理組，在酒精發酵初期反而降低了酵母活力，故選擇200、300、400 mg/L的添加量測定S.cerevisiae細胞通透率及抗氧化指標。
圖2甘露聚糖對釀酒酵母菌株活力的影響
2.2甘露聚糖對釀酒酵母細胞中ATP酶活性的影響
ATP又稱能量貨幣，是細胞內能量的主要載體。而ATP酶是真核細胞在有氧條件下產生細胞ATP的重要酶，存在于組織細胞膜上，在物質運送、能量轉換及信息傳遞方面具有重要作用[13]。由圖3所示，隨著酒精發酵的進行，酵母細胞中ATP酶活性呈下降趨勢，是由于酒精發酵過程中產生酒精、有機酸等物質使酵母的生存環境逐漸惡劣，細胞活力逐漸下降。與對照相比，甘露聚糖的添加顯著增加了酒精發酵不同時期酵母細胞中ATP酶的活性。在酒精發酵第3天時ATP酶活性由高到低分別為MP3(21.25 U/mg)>MP2(18.81 U/mg)>MP4(17.07 U/mg)>CK(15.35 U/mg)，MP3處理組較對照組增加了39.1%(P<0.05)。綜上所述，在酒精發酵前添加甘露聚糖有利于提高酵母細胞中ATP酶的活性，尤其是在酒精發酵中期，增加了酵母細胞的抗逆性反應。
圖3甘露聚糖對釀酒酵母細胞中ATP酶活性的影響
2.3甘露聚糖對釀酒酵母細胞中SOD活性的影響
酵母可以通過多種途徑保護自身免受各種脅迫(包括氧化應激)，清除H2O2、超氧陰離子自由基等[3]，如通過抗氧化酶，包括SOD、CAT、GSH-Px等的水平來體現對氧化應激的適應性反應；也可以通過產生GSH清除溶液中的氧化劑，從而提高細胞的抗氧化水平。圖4為酒精發酵前添加不同濃度的甘露聚糖對酵母細胞中SOD活性的影響。由圖4可知，隨著酒精發酵的進行，酵母細胞中SOD活性呈下降趨勢。在酒精發酵不同時期對照組與處理組SOD的活性均無顯著性差異(P>0.05)，可見甘露聚糖的添加并未對S.cerevisiae細胞中SOD活性產生影響。
圖4甘露聚糖對釀酒酵母細胞中SOD活力的影響
2.4甘露聚糖對釀酒酵母細胞中活性氧的影響
少量ROS是酵母菌株正常生理代謝所必需的[14-16]。但酵母細胞內ROS過量積累會導致細胞損傷甚至死亡[17-19]。由圖5可知，在酒精發酵過程中，酵母細胞中的ROS先上升，隨著酒精發酵末期酵母的死亡而快速降低，在酒精發酵進行的第2、3、4天中處理組都顯著低于對照組。在酒精發酵第4天，MP3處理組中ROS含量較對照組顯著降低了27.5%；酒精發酵末期處理組與對照組無顯著差異。綜上所述，甘露聚糖有利于降低酒精發酵前期和中期S.cerevisiae細胞中的ROS含量，且MP3處理組酵母細胞ROS含量最低，有利于降低酵母細胞結構的損傷，提高S.cerevisiae菌株抗逆性。
圖5甘露聚糖對釀酒酵母細胞中ROS的影響
2.5甘露聚糖對釀酒酵母細胞中丙二醛含量的影響
MDA是ROS作用于脂質發生過氧化反應的終產物之一，通常將其作為膜脂過氧化作用強弱的一個重要標志[20]。由圖6可知，在酒精發酵過程中，S.cerevisiae細胞中MDA逐漸積累，且在酒精發酵第4天后，MDA含量大幅增加。在酒精發酵前期處理組與對照組不存在顯著差異，是因為在對數增長期酵母發酵活力良好。酒精發酵第4天時，MDA含量為MP2(7.05 mg/g)
圖6甘露聚糖對釀酒酵母細胞中MDA含量的影響
2.6甘露聚糖對釀酒酵母細胞和模擬汁谷胱甘肽含量的影響
在生物體內起重要生理作用的是GSH，它與氧化型谷胱甘肽一起維持和調節細胞的氧化還原狀態[21-22]。它是一種內源性抗氧化物質，在葡萄酒酒精發酵期間，能夠有效防止葡萄酒中酚類物質的氧化，保護葡萄酒的芳香物質和色澤[23]。由圖7可知，酵母細胞中GSH含量在酒精發酵前期到中期呈上升趨勢，而在酒精發酵中期到后期呈下降趨勢，可能是由于酒精發酵初期酵母生存環境較好，未激發細胞的抗逆性反應。在酒精發酵初期，處理組酵母細胞中GSH含量與對照組不存在顯著性差異，而在酒精發酵的中期和后期GSH含量明顯增加。酒精發酵第3天時MP3處理組GSH含量最高，達到99.33 mg/g，較對照組增加了21.9%。第4天時細胞中GSH含量為MP3>MP2>MP4>CK，MP3處理組為62.26 mg/g，與對照組相比顯著增加了24.2%；酒精發酵末期，MP3、MP2和MP4處理組酵母細胞中GSH含量較對照組增加了70.1%、51.9%和31.9%。由圖8可知，與對照組相比，處理組模擬汁中GSH含量在酒精發酵的不同時期均高于對照組，但均未達到顯著性差異。綜上所述，在酒精發酵前添加甘露聚糖可顯著促進酵母細胞中GSH的合成，而對胞外GSH的分泌影響較小。因此，添加酵母多糖可增加酵母菌株的抗氧化能力，且添加質量濃度為300 mg/L時效果最佳。
圖7甘露聚糖對釀酒酵母細胞中GSH含量的影響
圖8甘露聚糖對模擬汁中GSH含量的影響
3討論
盧新軍等[23]指出，在酒精發酵過程中添加酵母細胞壁提取物可促進S.cerevisiae的生長繁殖，減輕乙醇對酵母的抑制甚至毒害作用，促進酵母的生理活性及生長代謝。ALSTEENS等[24]研究表明酵母細胞壁提取物可以通過提供不飽和脂肪酸和甾醇等營養物質促進葡萄汁和麥芽汁的快速完全發酵。NGELES等[25]研究表明酵母提取物中的主要活性成分是甘露聚糖，它可通過清除有毒的發酵產物，如中鏈脂肪酸或赭曲霉毒素A等，減少這些物質對酵母菌株的抑制作用，增加酵母菌株活力。郭守東[26]也在相關的研究結果中得出類似的結論。LUBBERS等[27]指出中鏈脂肪酸可以穿過酵母細胞質膜，使細胞質中ROS積累，導致酵母細胞結構受損，發酵活力降低。本研究結果表明，甘露聚糖可縮短S.cerevisiae菌株生長的遲滯期，有利于酵母菌株的快速適應和生長繁殖，對細胞活力具有顯著的提升作用(P<0.05)。
S.cerevisiae菌株在酒精發酵過程中會產生的乙醇、毒素等物質能抑制酵母菌株的代謝，使酵母細胞中ROS積累，從而破壞S.cerevisiae細胞結構的完整性，導致其代謝活力下降[28]。本實驗研究發現在酒精發酵前添加甘露聚糖，使酵母細胞中ATP酶活性顯著增加，ROS和MDA含量降低，GSH含量增加，且添加量為300 mg/L效果最好。SIES[29]指出，細胞自身防御氧化的途徑主要有2條，其中酶系防御體系主要通過抗氧化物酶清除自由基，如SOD、CAT等，而非酶系防御體系主要是通過產生GSH和金屬硫蛋白等還原性物質與自由基發生氧化還原反應來清除自由基，進而保護細胞不被氧化。結合本實驗中甘露聚糖能促進細胞中GSH的合成，表明甘露聚糖可能是通過非酶系防御體系途徑來提高S.cerevisiae細胞抗氧化性。有研究發現膠紅酵母粗多糖純化后各組分對羥自由基和超氧陰離子自由基具有很強的清除能力，且效果高于維生素C[30]。研究還發現甘露聚糖可以清除ABTS陽離子自由基、羥自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基和螯合Fe2+[8]。以上研究都是從清除自由基的基礎上研究多糖的抗氧化性，本實驗證實了甘露聚糖可通過增加ATP酶活性和GSH含量，并清除ROS和MDA含量來提高抗氧化性，提高S.cerevisiae的細胞活力。
4結論
本實驗以模擬葡萄汁為原料，研究甘露聚糖對S.cerevisiae菌株生長及抗氧化活性的影響。結果表明，甘露聚糖在S.cerevisiae菌株酒精發酵的全過程中均對酵母細胞活力具有顯著的提升作用(P<0.05)；外源添加300 mg/L甘露聚糖的處理組中酵母細胞的ATP酶顯著高于對照組(P<0.05)，而SOD活性不存在顯著差異(P>0.05)；在酵母菌株生長中后期，外源添加甘露聚糖的處理組中ROS、MDA含量顯著低于對照組(P<0.05)，并且酵母細胞內的GSH含量顯著高于對照組(P<0.05)，即添加甘露聚糖可通過促進酵母細胞中GSH的合成來清除細胞內過量的ROS、MDA，提高酵母細胞的抗氧化能力，并且質量濃度為300 mg/L時抗氧化能力最強。
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