RW、WK、SF發酵菌株不同組合對紫秋葡萄酒品質、香氣的影響（二）
1、材料與方法
1.1主要材料與試劑
紫秋葡萄：產自湖南懷化；皂土、白砂糖：市售；異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus，WK）、扣囊復膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera，SF）：湖北工業大學生物工程與食品學院實驗室篩選得到；果酒專用酵母（RW）：安琪酵母股份有限公司。
氯化鈉、偏重亞硫酸鉀、葡萄糖、磷酸二氫氨、磷酸二氫鉀、酒石酸鉀鈉、3，5-二硝基水楊酸、苯酚、氫氧化鈉（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠；酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸（均為色譜純）：南京源植生物科技有限公司；果膠酶（30 000 U/g）：北京索萊寶科技有限公司；2-乙基丁酸、乙酸正丁酯：美國Sigma-Aldrich公司；酵母提取物、蛋白胨、瓊脂粉：國藥集團化學試劑有限公司。
酵母膏蛋白胨液體培養基：酵母提取物10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，定容至1 L。
酵母膏蛋白胨固體培養基：酵母提取物10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，定容至1 L。
1.2主要儀器與設備
DH4000BⅡ電熱恒溫培養箱：天津市泰斯特儀器有限公司；7890A-5975B氣相色譜質譜聯用儀、1260 Infinity II高效液相色譜儀：美國Agilent公司；Super Alcomat高精度數顯酒精濃度計：上海點將精密儀器有限公司；5424R高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；μCount3D立體計數儀，丹麥Biosense公司；T6可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；57328-U頂空固相微萃取儀：上海安譜科學儀器有限公司。
1.3試驗條件
1.3.1發酵工藝
葡萄原料→除梗破碎→酶解→冷浸漬→調糖→酵母活化→接種酵母→前發酵→過濾→后發酵→陳釀→滅菌→灌裝→成品。
1.3.2操作要點
葡萄原料：挑選大小一致，無病蟲害、無霉變的成熟紫秋葡萄。
酶解：葡萄破碎后立即按1 g/100 L加入果膠酶（30 000 U/g），同時按60 mg/L加入偏重亞硫酸鉀。
冷浸漬：浸漬溫度5～8℃，浸漬時間24 h。
調糖：用白砂糖調節初始糖度至22%。
酵母活化：挑取平板上的WK與SF單菌落，分別接種到裝有酵母膏蛋白胨的液體培養基中，裝液量為150 mL/250 mL，于28℃、150 r/min培養36 h（此時菌體濃度應達到1×108 CFU/mL）備用；準確稱取10 g RW活性干酵母，按照酵母、葡萄糖與水體積比為1∶1∶10的比例進行混合，在35℃條件下靜置30 min，再加入10倍體積的紫秋葡萄汁，在28℃電熱恒溫培養箱中培養24 h備用。
接種酵母：1）單獨發酵：WK、SF與RW酵母接種量均為1%；2）混合發酵：WK與SF（以WK+SF表示）、RW與SF（以SF+RW表示）、RW與WK（以WK+RW表示）混合接種時酵母接種比例為1∶1（體積比），總接種量為1%。
前發酵：發酵容器為不銹鋼發酵罐，體積為12 L，裝液量75%，發酵溫度24℃，發酵時間9 d。
過濾：用四層脫脂紗布進行過濾。
后發酵：發酵溫度15℃，發酵時間15 d，裝液量90%。
陳釀：陳釀時加入皂土用于澄清，用量10 g/L，陳釀溫度5℃，陳釀時間30 d，裝液量90%。
滅菌：70℃滅菌15 min。
1.3.3菌體數量測定
酵母計數方法采用μCount3D立體計數儀，酵母在TSB中生長過夜。使用0.2 μm過濾器對10 mL 0.9%NaCl緩沖液進行無菌過濾，以去除緩沖液中的顆粒。一夜之間，酵母在Eppendorf管中稀釋100倍，達到所需的起始濃度約1×107。使用μCassetteB，65 μL/室（BioSense Solutions，Farum，Denmark）測量酵母濃度，一式三份。使用μCount3D算法：細菌。實驗起始濃度測量為6.97×106，樣品離心管標記為“1”。對于IntuGrow平板計數，將試管“1”進一步稀釋，以達到預期的20-100個菌落計數。
1.3.4理化指標測定
還原糖含量的測定采用滴定法，總酸含量的測定采用酸堿滴定法，具體步驟參考白夢洋等的方法；酒精度參照GB 5009.225—2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》的方法測定；總酚含量的檢測采用可見分光光度法，具體步驟參照陳紅梅等的方法；花色苷的檢測采用pH示差法，具體步驟參考劉彩婷等的方法。
1.3.5有機酸檢測
有機酸檢測參照劉曉燕等的方法并稍作修改，色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相：體積分數1%的甲醇溶液和0.02 mol/L KH2PO4溶液（二者體積比3∶97），用磷酸調節pH值至2.8；等度洗脫；流速0.8 mL/min；柱溫30℃；進樣體積10μL；波長210 nm。
標準曲線制作：分別稱取酒石酸、蘋果酸、乳酸與檸檬酸有機酸標準品10 mg，用流動相定容至10 mL，得到各標準品濃度為1 mg/mL的混合標準溶液，梯度稀釋為1.00、0.50、0.25、0.10、0.05 mg/mL的混合標準溶液，于4℃下保存備用。
樣品測定：準確稱取25 mL葡萄汁或酒液，加入0.01 mol/L磷酸二氫氨試劑，定容至250 mL，取50 mL在4 000 r/min下離心10 min。取上清液，使用0.22μm濾膜過濾，將濾液裝入2 mL的進樣瓶中，裝液量為1 mL，等待上機測定。有機酸標準曲線的回歸方程及相關系數見表1。
表1 4種有機酸標準曲線的回歸方程及相關系數
1.3.6揮發性成分檢測
頂空固相微萃取條件：取5 mL葡萄酒于頂空瓶中，加入2 g NaCl，再加入50μL乙酸正丁酯（8.4 mg/mL）與50μL 2-乙基丁酸（9.2 mg/mL）作為混合內標，置于55℃的頂空固相微萃取儀中平衡15 min，將老化后的固相微萃取針頭插入平衡后的樣品頂空萃取30 min。
色譜條件：色譜柱DB WAX（60 m×0.25 mm×0.25μm）；載氣為高純He，流速1 mL/min，進樣口溫度230℃；采用不分流進樣模式。程序升溫：初始溫度為40℃保持2 min，然后以5℃/min的升溫速率升至90℃保持2 min，再以20℃/min的速率升至230℃，保持5 min。
質譜條件：70 eV電子能量，全掃描質量范圍20～550 amu，離子源溫度230℃，傳輸線溫度280℃；四極桿溫度150℃。
1.3.7感官分析
參照Englezos等和Wang等的操作方法并稍作修改。評價小組由15名感官評價人員組成（7男8女，年齡25～35歲），在通風良好、無異味的品酒室進行葡萄酒品評相關培訓并組成評定小組。葡萄酒香氣描述詞匯為果香、花香、發酵香、草本香、甜香和整體香氣強度，評分選取10分制（0為沒氣味，10為氣味最強）：0～＜3低強度，3～＜6中等強度，6～10高強度。結果以雷達圖呈現。
1.4數據處理
使用Microsoft Excel 2016對試驗所得數據進行整理，使用IBM SPSS Statistics 19.0進行顯著性分析，試驗結果以平均值±標準差表示，使用Origin 2020軟件進行主成分分析與作圖。