我國(guó)國(guó)內(nèi)流行的D型流感病毒株HY11生物學(xué)特性鑒定
流感病毒分為A、B、C、D四個(gè)亞型。D型流感病毒(InfluenzaD virus,IDV)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種流感病毒類型。研究表明，IDV在牛群中引發(fā)輕度至中度呼吸系統(tǒng)疾病，病毒可以同時(shí)在牛的上下呼吸道中進(jìn)行復(fù)制。流行病學(xué)研究顯示，IDV在北美、歐洲、亞洲、非洲等國(guó)家均有流行。牛被認(rèn)為是IDV的自然宿主。血清學(xué)研究表明，養(yǎng)殖廠從業(yè)人員血清中可以檢測(cè)到IDV的抗體存在，顯示其可能感染人。但是還沒(méi)有分離到活病毒粒子。因此，分離并鑒定出D型流感病毒對(duì)流感病毒的研究具有重要意義。
疫苗是防控流感病毒感染和傳播最有效的手段。流感病毒滅活疫苗應(yīng)用最為普遍。IDV是引起牛呼吸系統(tǒng)疾病綜合征的重要關(guān)聯(lián)因子，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)有潛在嚴(yán)重危害。目前國(guó)內(nèi)尚沒(méi)有相關(guān)疫苗用于養(yǎng)殖動(dòng)物預(yù)防該病的研究。因此，開(kāi)展流行病學(xué)調(diào)查，選擇我國(guó)國(guó)內(nèi)流行的D型流感病毒株，制備可以保證免疫及保護(hù)效果的滅活疫苗是非常必要的。
2D型流感病毒生物學(xué)特性鑒定
(1)透射電鏡觀察
電鏡下所見(jiàn)病毒粒子呈球狀，其表面有纖突，病毒顆粒大小(100-120nm)和形態(tài)符合流感病毒的典型特征。
(2)間接免疫熒光
為了進(jìn)一步證明從牛身上分離的病毒能夠在細(xì)胞培養(yǎng)物中復(fù)制，通過(guò)免疫熒光分析來(lái)證實(shí)。然而，目前還沒(méi)有針對(duì)IDV的商用抗體，因此定制了一種針對(duì)D/bovine/Oklahoma/660/2013株原型的核蛋白(NP)的定制抗體(北京義翹神州科技股份有限公司，貨號(hào)MF17MY2622)。之前文獻(xiàn)報(bào)道已經(jīng)證明了用于免疫熒光(IF)的NP-抗體的特異性(NP抗體Holwerda M,Kelly J,Laloli L,Stürmer I,Portmann J,Stalder H,DijkmanR.Determining the Replication Kinetics and Cellular Tropism of Influenza DVirus on Primary Well-Differentiated Human Airway EpithelialCells.Viruses.2019Apr24；11(4):377.doi:10.3390/v11040377.PMID:31022887；PMCID:PMC6521319.)。病毒感染48小時(shí)后，可檢測(cè)到相當(dāng)數(shù)量的病毒抗原陽(yáng)性細(xì)胞。
(3)生長(zhǎng)曲線
測(cè)定了第五代細(xì)胞毒株、雞胚毒株以及噬斑純化后斑塊感染HRT-18G細(xì)胞毒株的病毒滴度，結(jié)果為105.25～106.25TCID50/mL左右。
研究了HY11毒株在HRT-18G(購(gòu)自于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)，ATCC NO.CRL-11663)、MDCK(購(gòu)自于武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號(hào)CL-0153)、MDBK(購(gòu)自于武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號(hào)CL-0154)以及原代牛睪丸細(xì)胞(購(gòu)自于北京博易匯科生物技術(shù)有限公司)的復(fù)制動(dòng)力學(xué)，通過(guò)TCID50滴定了病毒在MDCK細(xì)胞中的病毒滴度。以0.1倍感染率(MOI)接種HRT-18G、MDCK、MDBK以及Bovine testicle cell細(xì)胞HY11株，在不同時(shí)間點(diǎn)(24、48、72和96小時(shí))收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。結(jié)果表明，分離出的HY11在這幾種細(xì)胞中復(fù)制活躍，趨勢(shì)相似，72小時(shí)后達(dá)到最高滴度。圖1所示為間隔24小時(shí)的生長(zhǎng)曲線。
(4)系統(tǒng)發(fā)育分析
使用MEGAXI對(duì)HEF基因片段的核苷酸序列進(jìn)行了排列和分析，并進(jìn)行了1000次引導(dǎo)重復(fù)。主要節(jié)點(diǎn)左側(cè)的Bootstrap分?jǐn)?shù)至少為70。IDV五個(gè)現(xiàn)存譜系(D/OK-、D/660-、D/Yama2016-、D/CA2019-和D/Yama2019--品系)的每個(gè)分支分別用藍(lán)色、橙色、紫色、綠色和紅色標(biāo)出。本研究中描述的菌株(D/bovine/Jilin/HY11/2023,D/bovine/Jilin/HY15/2023and D/bovine/Jilin/HY19/2023)用星號(hào)標(biāo)記。在中國(guó)發(fā)現(xiàn)的菌株加粗標(biāo)出，結(jié)果如圖2所示。
結(jié)論
D型流感病毒的保藏名稱為D/bovine/Jilin/HY11/2023，拉丁名為Influenza D virus，于2024年01月05日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCCNO：45769。電鏡下觀察到流感病毒樣粒子，間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明其是D型流感病毒株。通過(guò)熒光分子進(jìn)化樹(shù)分析顯示該毒株是中國(guó)流行株，目前已獲得其全基因序列，同時(shí)測(cè)定了其在細(xì)胞上的生長(zhǎng)曲線，顯示其可以在細(xì)胞上生長(zhǎng)良好，此外，HY11可以在雞胚中進(jìn)行高滴度的增殖，為研制D型流感病毒滅活疫苗提供了基礎(chǔ)。HY11培養(yǎng)后經(jīng)滅活、濃縮、純化，免疫豚鼠后可以產(chǎn)生高滴度的抗體，抵抗D型流感病毒野毒株的攻擊，可以有效預(yù)防D型流感病毒。
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