低鹽發(fā)酵甜瓣子體系中產(chǎn)生物胺的菌株與降解菌株能力研究【下】
3結(jié)果與分析
3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線
生物胺標(biāo)準(zhǔn)曲線如表3所示，其回歸系數(shù)R2均≥0.998，可滿足檢測要求。
表3生物胺標(biāo)準(zhǔn)曲線
3.2產(chǎn)胺菌株篩選結(jié)果
3.2.1產(chǎn)胺菌株初篩結(jié)果由于生物胺顯堿性，產(chǎn)胺菌株在顯色培養(yǎng)基中呈現(xiàn)紫色，不產(chǎn)生物胺或降解生物胺菌株在顯色培養(yǎng)基上不變色。過夜培養(yǎng)后得到培養(yǎng)基變紫的初篩菌株如圖1a所示，挑取這些菌株進行分離、純化，如圖1b所示，得到產(chǎn)胺菌株46株。
圖1產(chǎn)胺菌株顯色培養(yǎng)基顯色形態(tài)（a）及LB平板培養(yǎng)形態(tài)（b）
3.2.2產(chǎn)胺菌株復(fù)篩結(jié)果將初篩菌株接種至生物胺液體顯色培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h，篩選培養(yǎng)后培養(yǎng)液為紫色的菌株為產(chǎn)胺菌株，如圖2所示，篩選得到32株產(chǎn)胺菌。
通過固體顯色培養(yǎng)基初篩，液體顯色培養(yǎng)基復(fù)篩，再經(jīng)過16S rDNA、18S rDNA和ITS測序，通過BLAST比對序列，采用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。
圖2產(chǎn)胺菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹
結(jié)果顯示甜瓣子中所篩選出代謝生物胺的菌株主要為芽孢桿菌屬、短桿菌屬、腸桿菌屬及少量小孢根霉，這與Jeon等[15]發(fā)現(xiàn)韓國傳統(tǒng)豆醬Cheonggukjang中，主要由腸球菌屬和芽孢桿菌屬生成生物胺的研究結(jié)果一致。
3.2.3高效液相色譜測定培養(yǎng)液中生物胺含量經(jīng)高效液相色譜測定，得到復(fù)篩的產(chǎn)胺菌株培養(yǎng)液中生物胺含量如圖3所示。
圖3產(chǎn)胺菌株培養(yǎng)液中生物胺含量（mg/mL）
結(jié)合空白組進行分析可以得出，所篩出菌株培養(yǎng)液中生物胺總量均遠高于空白組中生物胺總量，不同菌株之間產(chǎn)生物胺能力存在較大差異，與空白組相比芽孢桿菌屬產(chǎn)組胺、酪胺的能力相對較強。其中，B11菌株產(chǎn)苯乙胺能力相對較強，含量達78.4 mg/kg；B16菌株產(chǎn)酪胺能力相對較強，含量達25.3 mg/kg。Y17菌株和Y20菌株具備較強的產(chǎn)腐胺、尸胺能力，其培養(yǎng)液中含量分別達257.5 mg/kg和92.8 mg/kg，挑選這4株菌株回接至甜瓣子發(fā)酵體系驗證產(chǎn)胺能力。
3.3高產(chǎn)胺菌株回接至不同鹽度甜瓣子模擬體系中產(chǎn)生物胺的能力
高產(chǎn)生物胺菌株回接結(jié)果如圖4所示。可看出，6%鹽度體系中生物胺含量遠高于9%和12%鹽度體系，且8種生物胺均有檢出，生物胺總量最高達4 207.6 mg/kg。對照組發(fā)酵過程主要產(chǎn)酪胺、腐胺、組胺和色胺，有少量尸胺檢出。該鹽度下，除B11號菌株外其余各菌株體系中生物胺總量均高于食品中生物胺建議總量1 000 mg/kg[16]。其中，B16回接體系中酪胺含量相對較高，含量為1 194.4 mg/kg，高于Ten等[17]、Nout等[18]提出的食品中酪胺為100～800 mg/kg的限量標(biāo)準(zhǔn)；Y17體系中腐胺含量較高，含量為3 363.9 mg/kg；Y20回接體系中高產(chǎn)尸胺，為1 160.4 mg/kg，表明6%鹽度發(fā)酵甜瓣子可能存在較大安全風(fēng)險。
圖4高產(chǎn)胺菌株回接6%、9%、12%鹽度甜瓣子模擬體系后產(chǎn)胺能力
在9%和12%含鹽量甜瓣子樣品中，生物胺總量最高分別為233.9，781.2 mg/kg，其生物胺組成相似。9%鹽度下B11高產(chǎn)苯乙胺220.06 mg/kg；12%鹽度下B11高產(chǎn)腐胺119.4 mg/kg、苯乙胺546.5 mg/kg，遠高于30 mg/kg的推薦量[17]。B16、Y17、Y20菌株在9%、12%鹽度回接體系中不產(chǎn)色胺，產(chǎn)生物胺種類和含量隨鹽度增加而減少，與對照組生物胺變化趨勢較為一致，可能是鹽對其生長起到了一定程度的抑制作用所致。精胺和亞精胺在不同含鹽量甜瓣子樣品中含量均較低。因此，實現(xiàn)甜瓣子低鹽化發(fā)酵不能一味的追求降低鹽的含量。
3.4生物胺降解菌株篩選結(jié)果
3.4.1不產(chǎn)胺菌株篩選結(jié)果挑選46株課題組前期從甜瓣子中篩選出的不同種屬菌株，活化后接種至生物胺液體顯色培養(yǎng)基中，篩選得到39株不產(chǎn)生物胺的菌株，主要為酵母菌、乳酸菌（表4）。
表4不產(chǎn)胺菌株篩選結(jié)果
3.4.2生物胺降解菌株初篩結(jié)果將上述不產(chǎn)胺菌株未變紫培養(yǎng)液衍生后于300 nm波長下檢測其熒光強度，初篩出降胺菌株。熒光檢測篩選結(jié)果如圖5所示。
圖5降胺菌株初篩熒光檢測結(jié)果
選取熒光強度弱于空白組的菌株，初步斷定為降解生物胺菌株（圖5），共篩選出降解生物胺菌株9株，其中酵母菌4株，乳酸菌4株，細(xì)菌1株。
3.4.3生物胺降解菌株復(fù)篩結(jié)果將上述菌株回接至生物胺質(zhì)量濃度為100 mg/L的BAs培養(yǎng)液，30℃培養(yǎng)12 h后，空白組未觀察到菌株的生長，其余組菌株均有生長，于620 nm波長下測定其吸光度值，從而判定其在以生物胺為唯一氮源的培養(yǎng)基下的生長狀況，結(jié)果如圖6所示。
圖6降解生物胺菌株BAs培養(yǎng)液OD值
研究結(jié)果表明，初步篩選的9株菌均具備降解生物胺的能力。其中，美極梅奇酵母23J-5、食竇魏斯氏菌1R8S39在BAs培養(yǎng)基下生長狀況較好，表明其降解生物胺的能力可能較高。熒光檢測結(jié)果顯示，9株菌株熒光強度均弱于空白組的菌株（圖7），表明其均為生物胺降解菌。
圖7生物胺降解菌株熒光檢測結(jié)果
3.4.4降胺菌株BAs培養(yǎng)液降解能力測定使用高效液相色譜測定各菌株BAs培養(yǎng)液生物胺含量并計算其降解率，結(jié)果如圖8所示。所篩選菌株都具有一定生物胺降解能力，然而均無法降解亞精胺，不同菌株降解不同種類生物胺的能力差異較大。9株菌株對色胺的降解率在14.10%～21.37%之間；苯乙胺的降解率在5.94%～20.09%之間；腐胺的降解率在14.46%～24.94%之間；尸胺的降解率在23.52%～30.82%之間；組胺的降解率在5.65%～33.43%之間；酪胺的降解率在4.75%～15.10%之間；精胺的降解率在34.67%～65.58%之間；其中，扣囊復(fù)膜酵母MTQ1004具備較強的降解腐胺、組胺、精胺能力，其降解率分別為24.94%，33.43%，65.58%；美極酶奇酵母23J-5具備較強的降解尸胺、酪胺能力，降解率分別為30.82%，15.10%；香腸乳桿菌F003具備較強的降解苯乙胺和色胺能力，降解率分別為20.09%，21.37%，且能降解除亞精胺外的其余7種生物胺。通過比較分析可知，扣囊復(fù)膜酵母（MTQ1004）和香腸乳桿菌（F003）的生物胺降解率相對較高，與楊利昆等[19]、趙佳迪[11]研究結(jié)果較為一致。
圖8降胺菌株BAs培養(yǎng)液的生物胺降解率（%）
3.5降胺菌株回接甜瓣子模擬體系驗證結(jié)果
3.5.1降胺菌株回接甜瓣子模擬體系的降解能力測定將上述降胺菌株回接至含100 mg/L生物胺的甜瓣子模擬體系中培養(yǎng)16 d，提取衍生后，通過高效液相色譜法測定生物胺含量，結(jié)果如圖9所示。由于尖包念珠菌為有害菌，因此不考慮回接應(yīng)用。其中，降胺能力最強的是香腸乳桿菌F003，與前期篩選結(jié)果一致，其對苯乙胺的降解率高達100%，對危害較大的組胺、酪胺和精胺的降解率分別可達57.61%，25.52%，45.99%；扣囊復(fù)膜酵母MTQ1004對苯乙胺和腐胺的降解率達100%，對組胺降解率為37.78%；其余菌株對各種生物胺均有一定的降解能力。
圖9甜瓣子模擬體系中的生物胺降解率（%）
在甜瓣子模擬體系下，菌株降解率與對應(yīng)菌株降解生物胺能力強弱較為一致。而降解生物胺種類數(shù)量減少，這與該菌株降解生物胺能力特性有所不同，可能是因為甜瓣子正常發(fā)酵時，環(huán)境因素對菌株降解生物胺能力造成影響所致[20]。
3.5.2降胺菌株回接甜瓣子模擬體系的感官評價由圖10可以看出，在回接純種發(fā)酵體系中，所篩選出降胺菌株發(fā)酵的甜瓣子感官評價結(jié)果存在一定差異。其中，生物胺降解能力較強的扣囊復(fù)膜酵母MTQ1004具有生物胺降解能力，而強化發(fā)酵的甜瓣子霉味較重，以腐臭味、氨味為主，感官品質(zhì)相對較差；生物胺降解菌株香腸乳桿菌F003強化發(fā)酵所得的甜瓣子同正常發(fā)酵的甜瓣子相比，其酯香、醬香味較濃，所得甜瓣子樣品感官品質(zhì)最佳，可以考慮用作低鹽化甜瓣子中的降胺發(fā)酵菌株。
圖10降胺菌株回接甜瓣子模擬體系的感官評價
4結(jié)論
本研究從4%鹽度甜瓣子中篩出產(chǎn)生物胺菌株32株，其中腸桿菌屬Y17、小孢根霉Y20、枯草芽孢桿菌B11和B16產(chǎn)生物胺能力最強，主要產(chǎn)酪胺、尸胺、腐胺、苯乙胺。鹽度對菌株產(chǎn)生物胺能力有明顯抑制作用，將4株菌株回接至甜瓣子發(fā)酵體系中，其中6%發(fā)酵體系含有大量生物胺，9%和12%發(fā)酵體系中產(chǎn)生物胺明顯得到抑制。
篩選出降解生物胺菌株9株；篩選出1株可用于甜瓣子低鹽化發(fā)酵的降胺菌株香腸乳桿菌F003，它能有效降解苯乙胺、組胺、酪胺和精胺等生物胺，在生物胺含量為100 mg/L時，降解率分別為100%，57.61%，25.52%，45.99%，且回接體系中感官品質(zhì)最佳，具有較好的生長能力，可考慮為甜瓣子低鹽發(fā)酵時的降胺菌株。
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