畢赤酵母植酸酶發(fā)酵工藝優(yōu)化：比生長(zhǎng)速率多少時(shí)甲醇流加補(bǔ)料效果最為理想？
植酸酶作為一種高效的飼料添加劑，在動(dòng)物體內(nèi)可以幫助其降解植酸鹽，改善磷和其他養(yǎng)分的消化吸收，減少養(yǎng)分排泄，提高磷的利用率，增加養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)對(duì)降低植酸磷對(duì)環(huán)境的污染有重要作用。目前，養(yǎng)殖業(yè)對(duì)植酸酶的需求越來(lái)越大，同時(shí)更加關(guān)注其成本。因此，提高植酸酶表達(dá)量，降低發(fā)酵成本成為植酸酶研究、生產(chǎn)的當(dāng)務(wù)之急。
畢赤酵母植酸酶發(fā)酵工藝優(yōu)化的研究已有很多報(bào)道。李洪淼等對(duì)巴斯德畢赤酵母的高密度發(fā)酵條件進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，并根據(jù)搖瓶發(fā)酵的優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行了補(bǔ)料方式的研究。黃魁英等[2]對(duì)植酸酶畢赤酵母基因工程菌PEY-2的發(fā)酵條件進(jìn)行了研究。郭美錦等對(duì)重組畢赤酵母表達(dá)工程植酸酶過(guò)渡相參數(shù)進(jìn)行了分析研究。閔兆升等采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)考察了不同工藝條件對(duì)畢赤酵母工程菌H311產(chǎn)植酸酶的影響。王興吉等對(duì)畢赤酵母H工程菌30 L發(fā)酵產(chǎn)植酸酶的發(fā)酵條件及該酶的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。
1研究方法
1.1實(shí)驗(yàn)材料
1.1.1菌株
重組畢赤酵母基因工程菌(Mut+)，由本公司自行構(gòu)建，分泌表達(dá)植酸酶。
1.1.2培養(yǎng)基
種子培養(yǎng)基為酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)鹽(BSM)培養(yǎng)基(用葡萄糖替換甘油)。
1.2方法
1.2.1種子培養(yǎng)
將保藏菌種接種到50 mL的YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)18～24 h，再按照10%接種量接種YPD培養(yǎng)基擴(kuò)培16～24 h，然后按照8%接種量接入發(fā)酵罐BSM培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)。
1.2.2發(fā)酵控制
流加氨水控制pH 4.5，底糖耗盡后通過(guò)流加含12 mL/L微量鹽(PTM1)培養(yǎng)基的60%的葡萄糖增加濕重，控制相同濕重(180 g/L左右)開(kāi)始誘導(dǎo)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求和測(cè)量的濕重控制不同比生長(zhǎng)速率(μ)0.01 h-1、0.015 h-1、0.02 h-1進(jìn)行相應(yīng)的甲醇補(bǔ)料誘導(dǎo)植酸酶表達(dá)。每隔8 h或16 h取樣測(cè)濕重，然后調(diào)節(jié)甲醇補(bǔ)料量為濕重與比生長(zhǎng)速率乘積。
1.2.3分析方法
細(xì)胞濕重測(cè)定：10 mL發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min后棄上清稱(chēng)重；植酸酶酶活測(cè)定：GB/T 18634—2009飼用植酸酶活性的測(cè)定分光光度法[12]。
2結(jié)果與討論
2.1對(duì)照實(shí)驗(yàn)
發(fā)酵液底料中含有30 g/L葡萄糖，葡萄糖耗盡之后DO回升，此時(shí)開(kāi)始流加60%的葡萄糖直至誘導(dǎo)所需濕重180 g/L(大約發(fā)酵時(shí)間24 h時(shí))，之后停止流加葡萄糖，饑餓30 min左右，開(kāi)始流加甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶。對(duì)照組甲醇流加策略參照Invitrogen畢赤酵母發(fā)酵手冊(cè)[13]進(jìn)行控制，速度從1 g/(L·h)開(kāi)始，每?jī)尚r(shí)提高0.5 g/(L·h)，直到甲醇流加速度為4.5 g/(L·h)時(shí)，停止繼續(xù)提高，并以該流速至發(fā)酵結(jié)束。
由圖1可知，發(fā)酵40 h時(shí)(大約誘導(dǎo)后15 h左右)，濕重186 g/L，酶活691 U/mL，隨后酶活和濕重隨發(fā)酵時(shí)間增加，發(fā)酵144 h時(shí)濕重出現(xiàn)輕微下降，最后兩個(gè)取樣點(diǎn)酶活基本相同，至發(fā)酵168 h時(shí)下罐，此時(shí)濕重408 g/L，酶活10 282 U/mL。
圖1對(duì)照酶活濕重曲線
2.2比生長(zhǎng)速率為0.01 h-1時(shí)的產(chǎn)酶狀況
甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶之前的過(guò)程同2.1。甲醇流加速度從1 g/(L·h)開(kāi)始，按照0.01 h-1乘以相應(yīng)的濕重(每8 h或16 h取樣測(cè)濕重，然后進(jìn)行相應(yīng)的甲醇流速調(diào)節(jié))所得的速度進(jìn)行甲醇補(bǔ)料。
由圖2可知，發(fā)酵40 h時(shí)，濕重192 g/L，酶活583 U/mL，隨后酶活和濕重隨發(fā)酵時(shí)間增加，酶活168 h時(shí)出現(xiàn)輕微下降，至發(fā)酵168 h時(shí)下罐，此時(shí)濕重457 g/L，酶活11 763 U/mL。以0.01 h-1的比生長(zhǎng)速率進(jìn)行甲醇流加，發(fā)酵最終消耗甲醇5.3 L，而對(duì)照組甲醇消耗6.2 L，盡管甲醇消耗比對(duì)照少14.5%，但是酶活卻比對(duì)照高14.4%。
圖2比生長(zhǎng)速率0.01 h-1時(shí)酶活濕重曲線
2.3比生長(zhǎng)速率為0.015 h-1時(shí)的產(chǎn)酶狀況
甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶之前的過(guò)程同2.1。甲醇流加速度從1 g/(L·h)開(kāi)始，按照0.015 h-1乘以相應(yīng)的濕重(每8 h或16 h取樣測(cè)濕重，然后進(jìn)行相應(yīng)的甲醇流速調(diào)節(jié))所得的速度進(jìn)行甲醇補(bǔ)料。
由圖3可知，發(fā)酵40 h時(shí)，濕重185 g/L，酶活423 U/mL，隨后酶活和濕重隨發(fā)酵時(shí)間增加，144 h時(shí)濕重出現(xiàn)下降，至發(fā)酵168 h時(shí)下罐，此時(shí)濕重482 g/L，酶活13 644 U/mL。以0.01 h-1和0.015 h-1的比生長(zhǎng)速率進(jìn)行甲醇補(bǔ)料，中前期酶活和對(duì)照相當(dāng)甚至比對(duì)照低，但是隨著發(fā)酵進(jìn)行，菌體濕重增大，甲醇流加量增大，最終發(fā)酵酶活都超過(guò)對(duì)照組。
圖3比生長(zhǎng)速率0.015 h-1時(shí)酶活濕重曲線
2.4比生長(zhǎng)速率為0.02 h-1時(shí)的產(chǎn)酶狀況
甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶之前的過(guò)程同2.1。甲醇流加速度從1 g/(L·h)開(kāi)始，之后按照0.02 h-1乘以相應(yīng)的濕重(每8 h或16 h取樣測(cè)濕重，然后進(jìn)行相應(yīng)的甲醇流速調(diào)節(jié))所得的速度進(jìn)行甲醇補(bǔ)料。
由圖4可知，發(fā)酵40 h時(shí)，濕重190 g/L，酶活712 U/mL，隨后酶活和濕重隨發(fā)酵時(shí)間一直增加，至發(fā)酵168 h時(shí)下罐，此時(shí)濕重524 g/L，酶活17 445 U/mL。以0.02 h-1的比生長(zhǎng)速率進(jìn)行甲醇補(bǔ)料時(shí)，酶活一直比對(duì)照和其他兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組高，可以推斷前期菌體適應(yīng)甲醇后，在一定范圍內(nèi)，甲醇量越高對(duì)產(chǎn)酶越有利。而以0.02 h-1的比生長(zhǎng)速率進(jìn)行甲醇流加，最終酶活比對(duì)照提高69.7%，因此，以合適的比生長(zhǎng)速率控制甲醇流加，可能會(huì)引起菌體代謝流的改變，更多的代謝能量和物質(zhì)流向產(chǎn)酶通路。
圖4比生長(zhǎng)速率0.02 h-1時(shí)酶活濕重曲線
由圖5可知，隨著底糖消耗DO逐漸降低，至16 h左右，底糖耗盡，DO回升，隨之開(kāi)始補(bǔ)糖流加，至發(fā)酵24 h左右濕重達(dá)到180 g/L，停糖饑餓30 min，此時(shí)DO大幅回升，然后按照1 g/(L·h)的速度流加甲醇3 h，之后按照各自甲醇流加策略分別進(jìn)行甲醇流加。發(fā)酵中期DO水平與甲醇流加量相關(guān)，甲醇流加量大，DO水平低，而發(fā)酵后期DO基本都跌零，但是通過(guò)對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行液相檢測(cè)，甲醇幾乎沒(méi)有殘留。
圖5不同比生長(zhǎng)速率下的溶氧量曲線
3結(jié)論
以不同的比生長(zhǎng)速率進(jìn)行甲醇流加補(bǔ)料，發(fā)酵酶活均比對(duì)照提高。以0.01 h-1，0.015 h-1，0.02 h-1比生長(zhǎng)速率進(jìn)行甲醇補(bǔ)料，酶活分別提高14.4%，32.7%，69.7%。以比生長(zhǎng)速率指導(dǎo)甲醇補(bǔ)料，既可以提高甲醇的利用率，又可以提高酶活力，從而降低發(fā)酵成本。受取樣時(shí)間的限制，本文根據(jù)比生長(zhǎng)速率進(jìn)行甲醇流速調(diào)整的時(shí)間間隔為8 h或16 h，如果利用可以在線檢測(cè)菌體密度的發(fā)酵反應(yīng)器，根據(jù)測(cè)得的菌體密度在線實(shí)時(shí)反饋調(diào)節(jié)甲醇流量，可能會(huì)得到更優(yōu)的結(jié)果。隨著比生長(zhǎng)速率的提高，酶活提高越多，在DO允許的情況下，繼續(xù)提高比生長(zhǎng)速率可能會(huì)更大地提高產(chǎn)酶量，而受反應(yīng)器及DO的限制，本文得到的最適比生長(zhǎng)速率為0.02 h-1。
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