多抗噬菌體菌株大腸桿菌E.coli PRE12在LB培養(yǎng)基和TB培養(yǎng)基下的生長曲線圖
噬菌體是一類侵染細(xì)菌、放線菌等微生物的病毒，它們數(shù)量多、體積小、繁殖快、基因組可塑性高，是病毒中最為普遍和分布最廣的群體。噬菌體污染具有多樣性和頑固性特點(diǎn)，生物發(fā)酵類企業(yè)一旦出現(xiàn)噬菌體污染現(xiàn)象，若不及時(shí)處理，就會(huì)迅速擴(kuò)散，甚至反復(fù)污染，造成不可估量的損失。
面對自然界存量遠(yuǎn)大于自己的噬菌體，細(xì)菌進(jìn)化過程中，為了適應(yīng)這種長期的生存壓力，協(xié)同進(jìn)化具備了多種防御噬菌體侵染的機(jī)制，于噬菌體侵染過程的不同階段起作用，比如CRISPR系統(tǒng)、限制修飾(R-M)系統(tǒng)等(Tock Mark R,Dryden David T F,Thebiology ofrestriction and anti-restriction.[J].Curr Opin Microbiol,2005,8:466-72)。目前，工業(yè)上通過馴化篩選抗噬菌體菌株，因操作簡單，效果顯著而被廣泛使用。但是目前各實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)企業(yè)研究抗噬菌體大腸桿菌會(huì)有意識的進(jìn)行時(shí)空分割，或者針對一種噬菌體的侵染進(jìn)行研究，獲得抵抗單一噬菌體的大腸桿菌，或者針對不同噬菌體的分別侵染進(jìn)行研究，獲得抵抗廣譜噬菌體的大腸桿菌，而環(huán)境中噬菌體種類繁雜，同一時(shí)段、同一空間感染噬菌體往往并非單一類型，而是多種噬菌體共同爆發(fā)，這一污染現(xiàn)象我們可以稱之為噬菌體群體爆發(fā)，而這些單一譜系和廣譜的抗噬菌體大腸桿菌面對這種實(shí)際發(fā)酵生產(chǎn)場景中經(jīng)常遇到的噬菌體群體爆發(fā)，效果甚微。
圖為大腸桿菌E.coli PRE12(方形)和E.coli BL21(DE3)(圓形)在LB培養(yǎng)基和TB培養(yǎng)基下的生長曲線圖；
實(shí)施：
多抗噬菌體菌株E.coli PRE12的抗噬菌體群體侵染能力和生長能力分析。
1.多抗噬菌體菌株E.coli PRE12的抗噬菌體性能分析。
(1)為了檢測多抗噬菌體菌株大腸桿菌E.coli PRE12在噬菌體污染環(huán)境中的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，進(jìn)行抗噬菌體性能檢測。具體步驟如下：挑取E.coli PRE12和E.coli BL21(DE3)單克隆，接種LB液體培養(yǎng)基(50mL/250mL錐形瓶)，37℃，200rpm培養(yǎng)12h，分別取約1×109
個(gè)細(xì)胞加入5mL半固體LB培養(yǎng)基混勻，平鋪在LB固體平板上層。室溫放置5-10min，待凝固后，平板等分3個(gè)區(qū)域，分別滴加5μL稀釋梯度為100、10-2、10-4的噬菌體樣(6組噬菌體樣，編號P01-P06，來源于污染噬菌體的生產(chǎn)車間和實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)NGS測序鑒定，每批爆發(fā)噬菌體污染的噬菌體種類眾多且不同，其噬菌體類型涵蓋I：dsDNA噬菌體；II：ssDNA噬菌體，起始噬菌體滴度約為108pfu/mL)，做好標(biāo)記，37℃培養(yǎng)12-24h，觀察噬菌斑出現(xiàn)情況。
(2)結(jié)果如圖8所示，相比較于E.coli PRE12平板的噬菌斑形成情況，不同組噬菌體樣更容易在E.coli BL21(DE3)平板上形成噬菌斑，表明E.coli PRE12菌株面對廣譜的復(fù)雜噬菌體環(huán)境，其抵抗噬菌體群體侵染能力增加了102-106倍，明顯優(yōu)于E.coli BL21(DE3)，在噬菌體污染環(huán)境中具備潛在的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
2.多抗噬菌體菌株E.coli PRE12、大腸桿菌E.coli BL21(DE3)和ER2566(唯地生物，貨號：EC1060)的抗噬菌體性能檢測。
(1)市場上可以獲得的具備噬菌體抗性的大腸桿菌表達(dá)宿主較少，ER2566具備T1噬菌體抗性，且被用于表達(dá)重組蛋白。為分析這三種表達(dá)宿主的抗噬菌體性能進(jìn)行噬菌斑檢測，方法同前，使用噬菌體樣為生產(chǎn)過程中爆發(fā)的噬菌體樣，編號P07和P08。經(jīng)NGS測序鑒定，兩組樣品的噬菌體種類眾多且不同，其噬菌體類型涵蓋I：dsDNA噬菌體；II：ssDNA噬菌體，起始噬菌體滴度約為108pfu/mL。
(2)結(jié)果如圖9所示，多抗噬菌體菌株E.coli PRE12具備顯著優(yōu)于E.coli BL21(DE3)和ER2566的抗噬菌體性能和應(yīng)用潛力。
3.多抗噬菌體菌株E.coli PRE12生長曲線測定。
(1)測定E.coli BL21(DE3)和E.coli PRE12的生長曲線。具體步驟如下：將E.coliBL21(DE3)和E.coli PRE12分別接種于3mL LB新鮮培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)12h。次日分別取500μL于50mLLB培養(yǎng)基中(250mL錐形瓶)，37℃，200rpm培養(yǎng)12h。培養(yǎng)至第0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h時(shí)分別取樣1mL，使用紫外分光光度計(jì)測定OD600。
(2)結(jié)果如圖10所示，E.coli BL21(DE3)(圓形)和E.coli PRE12(方形)的細(xì)胞生長能力無明顯差異。
4.多抗噬菌體菌株E.coli PRE12蛋白表達(dá)水平測定，具體步驟如下：
(1)重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒制備
為獲得EGFP蛋白表達(dá)質(zhì)粒，分別使用引物P01-F/P01-R擴(kuò)增SEQ ID NO.7所示的DNA序列和引物P-VF/P-VR擴(kuò)增pET-28a(+)獲得線性化載體，使用上述一步克隆試劑盒將EGFP片段插入到pET-28a(+)中，得到pET-28a-EGFP重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒，引物見表格1。
(2)重組蛋白表達(dá)菌株構(gòu)建
將EGFP蛋白表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-EGFP(目的蛋白攜帶His標(biāo)簽，29.2kDa)分別轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)、E.coli PRE12和ER2566，獲得EGFP的不同宿主的蛋白表達(dá)菌株。
(3)重組菌株誘導(dǎo)蛋白表達(dá)
挑取攜帶EGFP表達(dá)質(zhì)粒的E.coli BL21(DE3)、E.coli PRE12和ER2566重組菌株單克隆分別接種3mL液體LB培養(yǎng)基(50μg/mL kan)，37℃，200rpm培養(yǎng)12h。取500μL一級種子液，轉(zhuǎn)接50mL液體LB培養(yǎng)基(250mL錐形瓶)，37℃，200rpm培養(yǎng)10-14h。次日，取5mL二級種子液，轉(zhuǎn)接500mL TB培養(yǎng)基(3L錐形瓶)，37℃，200rpm培養(yǎng)至OD600
＝1.2時(shí)，降溫至25℃，使用終濃度0.5mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)12h。離心收集菌體，稱取濕菌1g，使用PBS緩沖液，1：20破菌(1g濕菌對應(yīng)20mL PBS)，離心收集上清，沉淀使用20mL PBS重懸，分別制備40μL上清+10μL 5×上樣緩沖液和40μL重懸沉淀+10μL 5×上樣緩沖液兩個(gè)樣品，煮沸5min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。結(jié)果如圖11所示，E.coli PRE12的重組蛋白表達(dá)性能總體等同或優(yōu)于E.coli BL21(DE3)和ER2566。
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