牛病毒性腹瀉病毒BVDV在MDBK細胞上一步生長曲線
牛病毒性腹瀉-黏膜病（Bovine viral diarrhea-mucosal disease，BVD-MD）由牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起，主要以口腔、食管、胃、腸等部位黏膜侵蝕性或潰瘍性病變、腹瀉、白細胞減少、持續(xù)性感染及懷孕母牛流產(chǎn)或產(chǎn)畸形胎兒等癥狀為特征[1-2]。BVDV在世界范圍內(nèi)廣泛流行，給養(yǎng)牛業(yè)國家造成嚴重的經(jīng)濟損失[3]。犢牛感染BVDV后，潛伏期7～9 d，發(fā)病率為2%～5%，犢牛死亡率可達90%。妊娠母牛在妊娠30～120 d間感染后可產(chǎn)持續(xù)性感染牛，持續(xù)性感染牛可持續(xù)排毒成為BVDV重要的傳染源，是飼養(yǎng)場無法根除BVDV的重要原因之一。通過檢測并淘汰持續(xù)性感染牛，是逐步實現(xiàn)BVDV凈化的重要手段。
牛病毒性腹瀉病毒感染是危害養(yǎng)牛業(yè)的重要疾病，開發(fā)檢測和診斷牛病毒性腹瀉的快速診斷技術(shù)對牛病毒性腹瀉的防控及凈化、推動養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展具有重要的意義。為了預(yù)防與控制牛病毒性腹瀉病毒感染，科研人員建立了諸多分子生物學(xué)診斷方法。應(yīng)用地高辛、生物素等標(biāo)記物標(biāo)記核酸探針，建立核酸雜交檢測方法，快速、簡便、經(jīng)濟地檢測BVDV[8]。白泉陽等[10]、宋爽等針對BVDV保守的5’UTR設(shè)計引物和探針，建立Taqman熒光定量PCR方法，方便、快速地檢測BVDV，該方法敏感度高、重復(fù)性好。
表1 BVDV RT-qPCR重復(fù)試驗結(jié)果
圖4 BVDV在MDBK細胞上一步生長曲線
熒光定量PCR方法具有操作簡便、特異性高、敏感性高、重復(fù)性好、可實時定量等特點。實時熒光定量PCR包括探針法和染料法，其中染料法相對探針法價格更低。目前熒光定量PCR已經(jīng)成為實驗室快速檢測和診斷病原的重要手段[12]。對于非致細胞病變型牛病毒性腹瀉病毒在培養(yǎng)細胞上不產(chǎn)生細胞病變，通過間接免疫熒光試驗或間接免疫過氧化物酶試驗測定接毒后不同時間點收獲病毒的TCID50，進而繪制非致細胞病變型牛病毒性腹瀉病毒在培養(yǎng)細胞上的生長動力學(xué)曲線，此種測定方法耗力費時。而應(yīng)用熒光定量PCR方法可快速定量地對病毒基因組進行檢測，因此本試驗將熒光定量PCR方法應(yīng)用于BVDV一步生長曲線的繪制中。
為了實現(xiàn)測定BVDV NCP型一步生長曲線，本試驗根據(jù)牛病毒性腹瀉病毒5’UTR保守序列設(shè)計熒光定量PCR引物，建立了檢測牛病毒性腹瀉病毒的SYBR Green熒光定量PCR方法并將該方法應(yīng)用于BVDV一步生長曲線的測定中。研究中所建立的SYBR Green熒光定量PCR方法具有良好的重復(fù)性和敏感性，但其存在不能特異性鑒別BVDV與豬瘟病毒的缺陷。這一缺陷，可根據(jù)瘟病毒屬成員5’UTR序列中的差異序列區(qū)設(shè)計特異性的探針，以改善熒光定量PCR方法的特異性。該方法的建立和應(yīng)用，為研究非致細胞病變型BVDV分離毒株的生長特性的研究提供了一定的參考。
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