空腸彎曲菌噬菌體生物學特性測定及生長曲線繪制（三）
2.5噬菌體vB_Cj_QDYZ功能注釋
噬菌體vB_Cj_QDYZ全基因組的功能注釋如圖3所示，全基因組一共有165個ORF，3個tRNA。其中有65個ORF編碼已知功能，另外100個編碼假設蛋白。對65個具有已知功能的ORF分類，主要有4種功能的蛋白:噬菌體結構蛋白、裂解蛋白、包裝蛋白、與噬菌體復制和代謝有關的蛋白。具體的注釋結果見附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035791)。
圖3噬菌體vB_Cj_QDYZ基因組功能注釋
噬菌體結構蛋白有:ORF10(主要衣殼蛋白)，ORF131(衣殼組裝蛋白)，ORF11和ORF34(頭部完成蛋白)，ORF133(頸部蛋白)，ORF13和ORF167(尾鞘穩定劑和完成蛋白)，ORF90、ORF91和ORF136(尾管蛋白)，ORF113(尾鞘蛋白)，ORF100(尾絲蛋白)。其中，尾管蛋白是噬菌體編碼尾部的蛋白，與吸附宿主菌密切相關。尾絲蛋白是噬菌體特異性識別宿主的物質基礎，噬菌體的尾絲蛋白在特定微生物檢測凈化等方面具有重要意義。
噬菌體裂解相關蛋白有2個:ORF66(內溶素)和ORF85(尾部溶菌酶)。噬菌體可能是通過表達這兩種蛋白來裂解宿主菌的。
噬菌體包裝蛋白:ORF107(末端酶大亞基)，ORF134(末端酶小亞基)。噬菌體包裝蛋白主要在噬菌體包裝時起重要作用。其他蛋白包括受體結合蛋白:ORF1、ORF2、ORF3、ORF4，與噬菌體結合細菌表面受體相關。
與噬菌體復制和代謝有關的蛋白有:ORF6、7(重組核酸內切酶)，ORF8(轉錄調控因子)，ORF37(RNA連接酶)，ORF48(聚合酶)，ORF55(重組和修復蛋白)，ORF63(脫氫酶)，ORF68(拓撲異構酶)，ORF97(氨基轉移酶家族蛋白)，ORF101(核糖核酸酶)，ORF158(DNA聚合酶)，ORF162(胸苷激酶)，ORF164(DNA引物酶亞基)，ORF12、ORF54和ORF87(歸巢核酸內切酶)，ORF71、ORF144和ORF145(解旋酶)，ORF61(dUTP焦磷酸酶)，ORF153(核酸外切酶)。其中，重組和修復蛋白的功能是將噬菌體基因組整合到宿主菌上。歸巢核酸內切酶參與DNA內含子的水平轉移和基因表達的調控。解旋酶是一類解開氫鍵的酶，一般在噬菌體DNA復制過程中起到催化雙鏈DNA解旋的作用。焦磷酸酶，參與DNA合成。核酸外切酶，具有從分子鏈的末端順次水解磷酸二酯鍵而生成單核苷酸作用的酶。
2.6噬菌體vB_Cj_QDYZ比較基因組分析
噬菌體vB_Cj_QDYZ與空腸彎曲菌噬菌體CP39、CJLB-10、CP30A、CPX、CP8的同源性分別為98.30%、94.77%、94.61%、97.69%、97.82%，比對覆蓋率分別為95%、91%、92%、92%、92%。彎曲菌噬菌體分為2個屬Fletchervirus和Firehammervirus。與vB_Cj_QDYZ相似度最高的噬菌體來自Eucampyvirinae亞科，Fletchervirus屬。初步推測空腸彎曲菌噬菌體vB_Cj_QDYZ可能是來自Eucampyvirinae亞科，Fletchervirus屬的新成員。
2.7噬菌體vB_Cj_QDYZ系統進化分析
如圖4-A所示，基于全基因組序列構建的進化樹結果表明，噬菌體vB_Cj_QDYZ與CampylobacterphageCP39具有最近的親緣關系。NCBI檢索發現，CampylobacterphageCP39是Eucampyvirinae亞科、Fletchervirus屬的成員。研究表明CP39是肌尾噬菌體。因此推測vB_Cj_QDYZ是肌尾噬菌體(Myoviridae)科、Eucampyvirinae亞科、Fletchervirus屬的成員。
A-基于全基因組構建的進化樹;B-基于內溶素序列構建的進化樹;C-基于主要衣殼蛋白構建的進化樹
圖4噬菌體vB_Cj_QDYZ進化關系分析
如圖4-B所示，噬菌體vB_Cj_QDYZ的內溶素和CampylobacterphageCPX的內溶素相似度最高;如圖4-C所示，vB_Cj_QDYZ的主要衣殼蛋白與CampylobacterphageCP39的最相近。標尺代表遺傳距離，遺傳距離越短代表親緣關系越近。明顯看出，圖4-B和圖4-C的進化樹標尺較長，遺傳距離較大。因此推斷噬菌體vB_Cj_QDYZ可能為一株新的空腸彎曲菌噬菌體。
2.8噬菌體在牛奶中的抑菌效果
如圖5所示，加入空腸彎曲菌噬菌體vB_Cj_QDYZ后，在正常環境下放置4 h后，通過平板計數法測定，哥倫比亞血平板上的空腸彎曲菌菌落總數從初始的1.0×107CFU/mL降低至1.17×105CFU/mL，降低了2個lg CFU/mL，充分說明噬菌體vB_Cj_QDYZ在牛奶中的殺菌率為99%。牛奶是容易被彎曲菌污染的食品，選擇牛奶作為研究對象具有實際參考價值。綜上所述，噬菌體vB_Cj_QDYZ具有良好的抗菌潛力。
圖5噬菌體vB_Cj_QDYZ在牛奶中的抑菌效果
3結論與討論
本研究以空腸彎曲菌2206為宿主菌，從雞糞中分離出一株空腸彎曲菌噬菌體，將其命名為vB_Cj_QDYZ。噬菌體在雙層平板上可形成清晰透亮的噬菌斑，這說明噬菌體具有很強的裂解能力。透射電鏡形態表明，噬菌體有一個正二十面體的頭部(直徑約100.81 nm)和一條可伸縮的尾部(長度約65.90 nm)，具有彎曲菌噬菌體典型的終端泡和空頭結構，屬于有尾噬菌體目，肌尾噬菌體科。大多數彎曲菌噬菌體屬于肌尾噬菌體。
生物學特性結果顯示，噬菌體具有良好的熱穩定性和pH穩定性，表現出噬菌體在某些惡劣環境下具有一定的適用性。噬菌體vB_Cj_QDYZ在30～60℃，pH值為3～12的環境下效價較穩定，這為噬菌體在實際家禽生產中的防控提供了理論依據。空腸彎曲菌主要寄居在雞等家禽的腸道中，雞的正常體溫是39.6～43.6℃，雞腸道的pH值主要為2～4，這說明噬菌體vB_Cj_QDYZ可以在雞的腸道中存活且保持較高效價，具有廣泛的應用范圍。噬菌體vB_Cj_QDYZ的最佳感染復數為0.01，充分表明了噬菌體的侵染能力較強。一步生長曲線表明，噬菌體的潛伏期是60 min，裂解期是150 min，爆發量是45 PFU/cell。因此，空腸彎曲菌噬菌體vB_Cj_QDYZ具有較短的潛伏期和較強的裂解能力。此外，加入不同感染復數的噬菌體顯著抑制了空腸彎曲菌的生長，表現出噬菌體vB_Cj_QDYZ具有很強的裂解能力。噬菌體vB_Cj_QDYZ在牛奶中的殺菌率為99%，實際應用價值較高，具有開發為新型空腸彎曲菌抗菌劑的潛力。
基因組學研究有利于從基因水平更深入了解空腸彎曲菌噬菌體。噬菌體vB_Cj_QDYZ基因組為雙鏈DNA，基因組全長為130 627 bp，G+C含量為26%。基因組大小位于130～140 kbp，根據ICTV對彎曲菌噬菌體的最新分類，噬菌體vB_Cj_QDYZ被命名為CP8 virus，且屬于Ⅲ組噬菌體，特異性受體是莢膜多糖，對空腸彎曲菌具有較強的裂解性能。Ⅲ組噬菌體是目前抑菌效果最好的空腸彎曲菌噬菌體。噬菌體一共有165個ORF，3個tRNA。其中65個ORF具有功能。此外，以全基因組序列構建的進化樹顯示，噬菌體vB_Cj_QDYZ與CampylobacterphageCP39具有最近的親緣關系以主要衣殼蛋白和內溶素序列構建的進化樹表明，噬菌體與其他的空腸彎曲菌噬菌體遺傳距離較遠，推斷噬菌體vB_Cj_QDYZ屬于Fletchervirus屬的新成員。此外，噬菌體vB_Cj_QDYZ不含有抗生素耐藥基因、毒力基因、過敏原基因等，安全性較高，適合于實際應用生產。
本研究分離純化一株裂解能力較強、穩定性良好、安全性較高的新型空腸彎曲菌噬菌體，能夠有效抑制空腸彎曲菌的生長，且特異性較強，具有開發為新型空腸彎曲菌抗菌劑的潛力，豐富了空腸彎曲菌噬菌體的資源，為防治空腸彎曲菌污染提供理論基礎和技術指導。