肌苷對酸土脂環酸芽孢桿菌的生長抑制效果、對橙汁品質影響——摘要、材料與方法
酸土脂環酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus acidoterristris）主要存在于酸性土壤及蘋果汁、番茄汁等酸性果汁中，是一種革蘭氏陽性細菌，具有嗜酸耐熱特性，好氧、無致病性，由該菌污染引起的果汁營養損失、風味劣變、出現沉淀等質量問題已成為制約果蔬加工及出口貿易的瓶頸。據報道，35%的果汁產品變質問題都是因酸土脂環酸芽孢桿菌污染引起的。該菌在不利條件下可形成抗逆性極強的芽孢，條件適宜時芽孢便會萌發生長，產生愈創木酚、2，6-二溴苯酚和2，6-二氯苯酚等代謝產物，散發出難聞氣味并引起產品沉淀，是果汁加工行業比較棘手的問題。
作為果汁產業的關鍵質量因子，關于酸土脂環酸芽孢桿菌的控制研究已有30多年。在已報道的滅菌方法中，物理法控制酸土脂環酸芽孢桿菌污染的能源及經濟消耗較大。高溫處理是生產中常用的控制酸土脂環酸芽孢桿菌污染的方法，熱處理雖具有殺菌時間短、滅菌效果好的優點，但對果汁的營養成分和感官品質破壞嚴重。新型滅菌技術中超高壓滅菌法對酸土脂環酸芽孢桿菌的殺滅效果較好，能較好地保存果汁產品的營養成分，然而對儀器的要求較高，經濟耗費較大。化學法對抑制酸土脂環酸芽孢桿菌也有一定的效果，生產上常用苯甲酸、亞氯酸、次氯酸鈉等來抑制酸土脂環酸芽孢桿菌，然而苯甲酸含有刺激性氣味，會影響果汁口感，亞氯酸在室溫下不穩定，極易分解，在使用過程中對操作技術的要求較高。
隨著人們健康意識的增強，具有抑菌性能的天然物質及其衍生物逐漸被開發并應用到食品工業中。有研究報道天然化合物如石榴提取物、葡萄籽提取物、胡椒提取物等對酸土脂環酸芽孢桿菌有一定的抑菌效果，但多數植物提取物含有葉綠素、花色素、黃酮類色素等或者具有不良氣味的揮發性氣體，而且達到生產要求的抑菌效果的使用劑量較大，往往會影響產品的色澤、口感及風味等感官品質。因此，果汁工業急需開創新型高效的有利于保存果汁營養成分的酸土脂環酸芽孢桿菌控制技術。
肌苷，又稱次黃苷，屬于人體的正常成分，無色、無味，目前常用于食品加工和制藥行業。有研究發現，肌苷可以促進細菌芽孢的復蘇，對蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌的芽孢復蘇均有促進的效果。然而，課題組在研究肌苷對酸土脂環酸芽孢桿菌芽孢萌發的影響時發現，它不僅不能促進該菌芽孢的萌發，反而能延緩其芽孢萌發并導致萌發后的營養菌體死亡。鑒于酸土脂環酸芽孢桿菌具有獨特的嗜酸耐熱生理特性，推測肌苷在酸性條件下對該菌可能有特異性抑菌作用。本文通過測定肌苷處理前、后的酸土脂環酸芽孢桿菌生長和生存情況，形態變化及生物膜形成能力來檢測肌苷對該菌的抑制效果，研究較好抑菌效果的肌苷添加量對橙汁酸度、糖度、色度及口感的影響，為開發控制酸性果蔬制品中酸土脂環酸芽孢桿菌污染的新型綠色高效抑菌劑提供參考。
1、材料與方法
1.1材料與儀器
酸土脂環酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus acidoterristris DSM 3922T），購于德國菌種保藏中心；肌苷、戊二醛、無水乙醇均為分析純，天津市德恩化學試劑有限公司；橙子為市售鮮果。
ZQTY-70F全溫振蕩培養箱；TGL-16B臺式高速離心機；ES-315全自動高壓滅菌器；H1987手持糖度折光儀；CR400便攜式色差儀；環境掃描電子顯微鏡；Varioskan LUX多功能酶標儀；MJBL80Y21美的榨汁機。
1.2培養基的制備
AAM液體培養基：葡萄糖2.0 g，酵母浸粉2.0 g，氯化鈣0.38 g，磷酸二氫鉀1.2 g，七水硫酸鎂1.0 g，一水硫酸錳0.38 g，硫酸銨0.4 g，加滅菌水定容至1 L，調pH值至4.0，121℃高壓滅菌15 min；
AAM固體培養基：在液體培養基的基礎上添加1.5%～1.8%的瓊脂。
1.3試驗方法
1.3.1菌株培養條件
將冷凍保藏的酸土脂環酸芽孢桿菌接種于AAM液體培養基中，在45℃、250 r/min條件下活化培養12 h，然后按1%接種量再轉接至AAM培養基中，45℃、250 r/min振蕩培養。
1.3.2光密度法測定酸土脂環酸芽孢桿菌生長曲線
將活化12 h的菌液按1%的接種量分別接種于含肌苷濃度為0，1，5，10，20，30 mmol/L的AAM液體培養基中，45℃、250 r/min振蕩培養24 h，每2 h測定一次菌液吸光值（OD600nm）。以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標，制作不同濃度肌苷處理下酸土脂環酸芽孢桿菌的生長曲線。
1.3.3結晶紫染色法測定生物膜形成量
采用的96孔板定量法，取20μL 106CFU/mL菌懸液置于96孔板中，每孔分別加入200μL含0，1，5，10，20，30 mmol/L肌苷濃度的AAM培養液。然后將96孔板置于45℃培養箱中靜置培養24 h，使細菌完全附著在孔板表面。培養結束后，每孔中加入0.01 mol/L的無菌PBS緩沖液清洗3次。待96孔板風干后，加入無水甲醇固定15 min，棄去孔中廢液后風干。然后加入1%的結晶紫溶液，置于室溫下染色15 min后，用流動去離子水洗去孔板中殘余的結晶紫染料后風干，再加入200μL 33%的冰乙酸溶液進行脫色。脫色完成后，用酶標儀測定每孔的OD600nm值，分析生物被膜形成量。
1.3.4環境掃描電子顯微鏡檢測酸土脂環酸芽孢桿菌形態
將活化至對數期的菌液以1%接種量分別加入肌苷濃度為0 mmol/L和5 mmol/L的培養液中，45℃、250 r/min振蕩培養，分別取培養6，12，18，24 h的菌液，離心收集菌體，用預冷的無菌水反復清洗3～5次，加入體積分數為2.5%的戊二醛溶液，置于4℃環境下固定2 h以上。將固定好的樣品用預冷的無菌水反復清洗后，利用35%，50%，70%，80%，90%和100%體積分數的乙醇進行梯度脫水后再用無水乙醇重懸。取適量菌懸液滴加于玻片上，自然風干后噴金，利用環境掃描電子顯微鏡觀察菌體形態。
1.3.5平板計數法測定
酸土脂環酸芽孢桿菌生存情況將菌體濃度為107CFU/mL的菌液分別接種至含0，1，5，10，20，30 mmol/L濃度肌苷的AAM培養液中，調整該菌液的初始菌濃度分別為105CFU/mL和106CFU/mL，45℃，250 r/min條件下振蕩培養72 h。每6 h取100μL菌液梯度稀釋后涂布于AAM固體平板上，45℃，倒置培養24 h后進行菌落計數，檢測酸土脂環酸芽孢桿菌的存活情況。
1.3.6鮮榨橙汁制備
選取成熟、飽滿的新鮮橙子，清洗干凈后加入適量純水，使用榨汁機制汁，用干凈的紗布過濾3～4次，90℃，5 min殺菌備用。
1.3.7果汁理化指標測定
在鮮榨橙汁中分別加入終濃度為0，1，5，10，20，30 mmol/L的肌苷，利用pH儀、手持式糖度折光儀、便攜式色差儀測定橙汁的酸度、糖度（可溶性固形物含量，TSS）、顏色參數等理化指標。樣品總色差計算公式為：
式中L*代表明暗度，a*代表紅綠色值，b*代表黃藍色值。
1.3.8果汁感官評定
對果汁感官鑒定的方法，制訂表1中鮮榨橙汁的評分標準，選擇10名食品專業的學生分別從氣味、色澤、口感、狀態4個方面對橙汁進行感官評價，總分為100分。
表1鮮榨橙汁的感官評分標準
1.4數據處理與分析
所有試驗重復3次，采用Origin9.0進行繪圖，運用SPSS 23軟件Duncan進行方差分析（ANOVA）（P<0.05），試驗結果以表示。
肌苷對酸土脂環酸芽孢桿菌的生長抑制效果、對橙汁品質影響——摘要、材料與方法
肌苷對酸土脂環酸芽孢桿菌的生長抑制效果、對橙汁品質影響——結果與分析
肌苷對酸土脂環酸芽孢桿菌的生長抑制效果、對橙汁品質影響——討論與結論
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