不同濃度的檸檬酸鈉對(duì)脫氮假單胞桿菌發(fā)酵過程的影響——摘要、結(jié)論與討論
摘要：維生素B12(Vitamin B12)又稱鈷胺素，通常用來表示含鈷離子的類咕啉(corrinoid)化合物，最早作為“抗惡性貧血因子”在1926年發(fā)現(xiàn)。作為一種重要的生理活性物質(zhì)，維生素B12是許多重要生物化學(xué)反應(yīng)所必需的輔酶，如分子內(nèi)重排作用、由三磷酸核糖核苷酸生成2′-三磷酸脫氧核糖核苷酸的還原反應(yīng)、分子間甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)等。
由于維生素B12的分子結(jié)構(gòu)極為復(fù)雜，其全化學(xué)合成需要多達(dá)70余個(gè)的反應(yīng)步驟，且成本昂貴，故目前幾乎都是通過微生物發(fā)酵的方式來生產(chǎn)維生素B12。而具備維生素B12合成能力的微生物有很多種，但目前成功應(yīng)用于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)維生素B12的菌株主要有費(fèi)氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudenreichii)、謝氏丙酸桿菌(Propionibacteriumshermanii)和脫氮假單胞桿菌(Pseudomonasdenitrificans)等。其中，脫氮假單胞桿菌更是因?yàn)槠渚S生素B12產(chǎn)率高，而成為當(dāng)前應(yīng)用最廣的維生素B12生產(chǎn)菌株。尤其是通過一系列發(fā)酵工藝的優(yōu)化，脫氮假單胞桿菌的維生素B12工業(yè)化發(fā)酵水平近年來得到了大幅度的提高，穩(wěn)定在200 mg/L以上。
并且經(jīng)過幾十年研究，脫氮假單胞桿菌中維生素B12生物合成途徑已經(jīng)得到闡明。Wang等利用13C同位素標(biāo)記代謝流分析的方法考察了維生素B12產(chǎn)生菌脫氮假單胞桿菌的中心代謝網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)糖酵解途徑(EMP途徑)的代謝活性很低，主要利用ED途徑分解代謝葡萄糖，并且存在較大通量的磷酸戊糖途徑(HMP途徑)。有文獻(xiàn)報(bào)道檸檬酸鈉結(jié)合葡萄糖代謝能阻止微生物發(fā)酵過程中副產(chǎn)物的合成，檸檬酸鈉作用于微生物發(fā)酵的探究也逐漸深入。劉新星等和陳雙喜等發(fā)現(xiàn)檸檬酸鈉能減弱丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶的活性，并能抑制EMP途徑和TCA循環(huán)之間的“碳源溢流”，增加HMP途徑的通量，大幅度提高肌苷產(chǎn)量。隨后，大量的文獻(xiàn)報(bào)道，添加檸檬酸鈉能在不影響菌體正常生長的情況下，減少發(fā)酵副產(chǎn)物的生成，改變目標(biāo)產(chǎn)物合成途徑關(guān)鍵點(diǎn)的代謝流分布，提高目標(biāo)產(chǎn)物合成途徑的代謝流量，提高胞內(nèi)NADPH、NADH和ATP的水平，促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物的合成和積累。
因此，本文通過搖瓶培養(yǎng)的方式，結(jié)合酶學(xué)方法，從發(fā)酵液pH、菌體生長量、維生素B12產(chǎn)量、有機(jī)酸含量和糖代謝途徑的關(guān)鍵酶活力等角度出發(fā)，考察了不同濃度的檸檬酸鈉對(duì)脫氮假單胞桿菌發(fā)酵過程的影響，并總結(jié)出添加濃度為0.3%的檸檬酸鈉最有利于脫氮假單胞桿菌發(fā)酵產(chǎn)維生素B12。
結(jié)論與討論
由于維生素B12的化學(xué)結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，合成過程高度繁瑣。使得應(yīng)用化學(xué)方法來工業(yè)化生產(chǎn)維生素B12在技術(shù)上存在很大的難度，成本十分昂貴。而在脫氮假單胞桿菌發(fā)酵產(chǎn)維生素B12過程中，添加一些維生素B12合成所必需的化合物是非常必要的。例如鈷離子和5，6-二甲基苯并咪唑。另外，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加甘氨酸、蘇氨酸、5-氨基乙酰丙酸、甜菜堿和膽堿等甲基供體，也能促進(jìn)維生素B12的合成，特別是膽堿能增加膜透性。除此之外，不同的無機(jī)氮源對(duì)P.denitrificans代謝產(chǎn)維生素B12的影響也是不一樣的，彭衛(wèi)福等通過研究發(fā)現(xiàn)，硫酸銨是維生素B12發(fā)酵較為適宜的無機(jī)氮源，高濃度的NH4+能明顯促進(jìn)菌體的生長，但是會(huì)對(duì)維生素B12的合成產(chǎn)生一定的負(fù)作用。
為了進(jìn)一步闡明檸檬酸鈉添加對(duì)P.denitrificans代謝途徑所產(chǎn)生的影響，研究發(fā)酵過程有機(jī)酸和糖代謝途徑關(guān)鍵酶酶活力的時(shí)序性動(dòng)態(tài)變化發(fā)現(xiàn)：在TCA循環(huán)中，琥珀酸是由琥珀酰CoA水解生成，而琥珀酰CoA是脫氮假單胞桿菌合成維生素B12的重要前體物質(zhì)。由此可見，檸檬酸鈉抑制琥珀酸的生成，可能會(huì)使得大量的琥珀酰CoA得以流向維生素B12合成途徑。另外，檸檬酸鈉促進(jìn)蘋果酸的快速利用，產(chǎn)生大量的還原力NADH，更好地滿足了維生素B12合成所需。本文所測定的5個(gè)酶均為代謝網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵酶，根據(jù)Wang等的研究結(jié)果，并結(jié)合前文中維生素B12合成量分析推測，在脫氮假單胞桿菌中心代謝途徑中存在較大通量的HMP途徑，這可能是HMP途徑為菌體生長提供大量的前體代謝物，而較高濃度的檸檬酸鈉提高了葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活力，從而提高了HMP途徑的通量，為維生素B12的合成提供了大量的NADPH，故維生素B12產(chǎn)量大幅度增加。此外，由于檸檬酸鈉與葡萄糖的聯(lián)合作用增加了細(xì)胞內(nèi)磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的濃度，而PEP是磷酸果糖激酶的強(qiáng)烈抑制劑，而磷酸果糖激酶的活力受高濃度ATP的抑制，檸檬酸鈉增強(qiáng)了ATP對(duì)磷酸果糖激酶的抑制作用，因此減緩了糖酵解途徑的速率。TCA循環(huán)中，檸檬酸合成酶的活力也受到了一定的限制作用。由此可見，檸檬酸鈉的添加可增加P.denitrificans中HMP途徑的代謝通量，而這可為維生素B12的合成提供充足的還原力NADPH，從而有利于維生素B12發(fā)酵產(chǎn)量的提高。
綜上所述，檸檬酸鈉的添加提高了胞內(nèi)ATP的含量，增加了HMP途徑的代謝通量，降低了EMP和TCA循環(huán)的代謝流量，為維生素B12的合成提供充足的還原力NADPH，有利于維生素B12產(chǎn)量的提高。
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