枯草芽孢桿菌BC80-6發(fā)酵培養(yǎng)基、生長(zhǎng)條件及對(duì)煙草根黑腐病菌生防作用（二）
2、結(jié)果與分析
2.1、處理液對(duì)煙草根黑腐病菌菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)的影響
由表1可知，3種枯草芽孢桿菌BC80-6處理液對(duì)煙草根黑腐病菌菌絲的生長(zhǎng)均具有抑制作用。隨著處理液稀釋倍數(shù)的增加，其對(duì)BC80-6菌絲生長(zhǎng)的抑制率逐漸減小。其中，活菌液的抑制效果最好，10-1倍的活菌液對(duì)BC80-6菌絲生長(zhǎng)的抑制率為93.20%。10-1倍的過(guò)濾液和高溫滅菌液對(duì)BC80-6菌絲生長(zhǎng)的抑制率分別為74.9%、7.4%，高溫滅菌液抑制效果最差。
表1不同處理液對(duì)煙草根黑腐病菌的抑制作用
3種枯草芽孢桿菌BC80-6處理液對(duì)煙草根黑腐病菌孢子的萌發(fā)均具有抑制作用（表1）。其中，活菌液和過(guò)濾液對(duì)煙草根黑腐病菌孢子的萌發(fā)均具有較好的抑制作用，10-1倍的活菌液和過(guò)濾液對(duì)孢子萌發(fā)的抑制率分別為95.3%、93.4%。隨稀釋倍數(shù)的增加，活菌液和過(guò)濾液對(duì)孢子萌發(fā)的抑制率逐漸降低，且不同稀釋倍數(shù)之間差異顯著。滅菌液的抑制效果最差，10-1、10-2、5×10-2倍的滅菌液對(duì)孢子萌發(fā)的抑制率為30.3%、3.8%和2.4%。
2.2、培養(yǎng)基成分的優(yōu)化
2.2.1碳源的優(yōu)化
由圖1可知，菌株BC80-6在不同碳源培養(yǎng)基中均可生長(zhǎng)。其中，在蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中，菌株BC80-6的活菌含量最高，為1.58×109 cfu·mL-1；葡萄糖和乳糖次之，其活菌含量分別為1.42×109和1.39×109 cfu·mL-1。因此，菌株BC80-6生長(zhǎng)的最佳碳源是蔗糖，其次是葡萄糖。
圖1碳源對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響
2.2.2氮源的優(yōu)化
由圖2可知，氮源為有機(jī)氮時(shí)菌株BC80-6的生長(zhǎng)明顯優(yōu)于無(wú)機(jī)氮。以無(wú)機(jī)氮（尿素、氯化銨）為氮源，菌株BC80-6的活菌含量較少（<0.28×109 cfu·mL-1），說(shuō)明菌株BC80-6不能很好地利用這兩種氮源。以有機(jī)氮（酵母浸出物、牛肉膏、蛋白胨和大豆蛋白胨）為氮源，菌株BC80-6的活菌含量均高于1.2×109 cfu·mL-1。菌株BC80-6生長(zhǎng)的最適氮源是酵母浸出物，活菌含量為1.95×109 cfu·mL-1。
圖2氮源對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響
2.2.3無(wú)機(jī)鹽的優(yōu)化
由圖3可知，菌株BC80-6在無(wú)機(jī)鹽為MgSO4、CaCl2、NaCl2的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較好，活菌含量較多，分別為1.98×109、1.54×109和1.52×109 cfu·mL-1。菌株BC80-6不適合在含F(xiàn)eSO4的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，活菌含量?jī)H為0.62×109 cfu·mL-1，遠(yuǎn)小于CK（1.4×109 cfu·mL-1）的活菌含量。因此，菌株BC80-6在無(wú)機(jī)鹽為MgSO4的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好。
圖3無(wú)機(jī)鹽對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響
2.3、碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽3因素的正交優(yōu)化
由2.2節(jié)結(jié)果可知，最佳碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽的種類分別是：蔗糖、酵母浸出物、MgSO4。蔗糖、酵母浸出物、MgSO4各設(shè)3個(gè)含量水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)（表2）。
表2正交試驗(yàn)因素和水平編碼
正交試驗(yàn)結(jié)果（表3）表明：當(dāng)培養(yǎng)基中的酵母浸出物、蔗糖、MgSO4含量分別為0.5%、1.5%、0.06%時(shí)，菌株BC80-6的活菌含量最高，即最適合菌株BC80-6的生長(zhǎng)。R值能反應(yīng)3種因子對(duì)活菌含量影響的大小，R值越大，則該因子的影響越大。RA>RB>RC，即酵母浸出物含量對(duì)菌株BC80-6生長(zhǎng)的影響最大，為主要因子，蔗糖含量其次，MgSO4影響最小。
表3 L9（33）正交試驗(yàn)結(jié)果①
注：①K1、K2、K3分別代表各因素1、2、3水平的3次活菌含量之和；k1、k2、k3分別代表對(duì)應(yīng)K的平均值；R代表極差值，即各因素各水平下k值對(duì)應(yīng)的最大值與最小值之差。
F檢驗(yàn)結(jié)果（表4）表明：酵母浸出物的F值最大，為110.789（>F0.01），呈極顯著差異，是主要影響因素。蔗糖的F值介于F0.01與F0.05之間，呈顯著差異。硫酸鎂的F值<F0.05，對(duì)菌株BC80-6生長(zhǎng)的影響較小。
表4正交試驗(yàn)的方差分析
2.4、發(fā)酵條件的優(yōu)化
2.4.1生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
由圖4可知，0~3 h為菌株BC80-6的生長(zhǎng)停滯期，活菌含量增長(zhǎng)較少。3 h后菌株BC80-6生長(zhǎng)較快，活菌含量大幅增加。9~24 h，菌株BC80-6生長(zhǎng)穩(wěn)定，活菌含量增長(zhǎng)緩慢。24 h活菌含量達(dá)到最大，為2.5×109 cfu/mL。24 h后活菌含量開始減少，菌株BC80-6進(jìn)入生長(zhǎng)衰亡期。因此，選用培養(yǎng)9~24 h的菌液為菌種較合適，此時(shí)菌株BC80-6在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，既有較高的細(xì)胞活力，又可獲得較多的細(xì)胞數(shù)。
圖4枯草芽孢桿菌BC80-6的生長(zhǎng)曲線
2.4.2培養(yǎng)溫度的優(yōu)化
由圖5可知，菌株BC80-6適宜在25~28℃生長(zhǎng)。在28℃時(shí)，其發(fā)酵液里活菌含量最多，為2.52×109 cfu/mL。因此，28℃是菌株BC80-6的最適培養(yǎng)溫度。
圖5溫度對(duì)枯草芽孢桿菌BC80-6生長(zhǎng)的影響
2.4.3培養(yǎng)液初始pH的優(yōu)化
由圖6可知，當(dāng)pH在5.5~6.5之間，菌株BC80-6的活菌含量隨pH的增大而增大。當(dāng)pH為6.5時(shí)，活菌含量達(dá)到最大，為2.44×109 cfu/mL。當(dāng)pH在6.5~8.0之間，隨著pH的增大，菌株BC80-6的活菌含量明顯下降。因此，培養(yǎng)液的pH應(yīng)控制在6.5左右。
圖6 pH對(duì)枯草芽孢桿菌BC80-6生長(zhǎng)的影響
2.4.4接種量的優(yōu)化
當(dāng)接種量為5%時(shí)，菌株BC80-6的活菌含量最多，為2.48×109 cfu/mL。因此，5%的接種量為最適接種量。
2.4.5轉(zhuǎn)速的優(yōu)化
轉(zhuǎn)速?gòu)?20 r/min增加至180 r/min時(shí)，菌株BC80-6的活菌含量逐漸增加，轉(zhuǎn)速?gòu)?80 r/min增加至220 r/min時(shí)，活菌含量逐漸減少。轉(zhuǎn)速為180 r/min時(shí)，菌株BC80-6的活菌含量最多，為2.48×109 cfu/mL，表明轉(zhuǎn)速影響菌株BC80-6的生長(zhǎng)。因此，菌株BC80-6的最佳轉(zhuǎn)速為180 r/min。
2.4.6裝液量的優(yōu)化
裝液量不同，菌株BC80-6的活性不同。當(dāng)250 mL三角瓶的裝液量在20~40 mL之間時(shí)，菌株BC80-6的活菌含量隨裝液量的增加而增加。當(dāng)250 mL三角瓶的裝液量大于40 mL時(shí)，活菌含量隨裝液量的增加而下降。裝液量為40 mL時(shí)，菌株BC80-6的活菌含量最多，為2.46×109 cfu/mL。因此，搖床培養(yǎng)時(shí)，250 mL三角瓶的最佳裝液量為40 mL。
2.5枯草芽孢桿菌BC80-6對(duì)煙草根黑腐病的田間防控效果
大多數(shù)對(duì)照組煙苗出現(xiàn)明顯的根黑腐病癥狀，煙苗根系出現(xiàn)黑色腐爛，植株明顯矮化，葉片萎蔫，長(zhǎng)勢(shì)較差。菌株BC80-6處理的煙苗地上部分較少出現(xiàn)萎蔫癥狀，長(zhǎng)勢(shì)較好，根部正常。由表5可知，菌株BC80-6處理的煙株發(fā)病率和病情指數(shù)顯著低于對(duì)照組，大田防治效果達(dá)88.19%。與生產(chǎn)上使用的化學(xué)藥劑（多菌靈和甲基托布津）防治效果差異不大。
3、討論
枯草芽孢桿菌可通過(guò)產(chǎn)生抗菌物質(zhì)來(lái)抑制病原菌的生長(zhǎng)。本研究中，枯草芽孢桿菌BC80-6的過(guò)濾液和滅菌液對(duì)煙草根黑腐病菌的菌絲和孢子有一定抑制作用，表明菌株BC80-6可產(chǎn)生某些抗菌物質(zhì)來(lái)抑制煙草根黑腐病菌的生長(zhǎng)。菌株BC80-6活菌液對(duì)煙草根黑腐病菌菌絲和孢子的抑制效果最好，可能是由于菌株BC80-6不斷繁殖產(chǎn)生更多抗菌物質(zhì)，或與病原菌不斷爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)，從而有效地抑制病原真菌生長(zhǎng)。
通過(guò)發(fā)酵試驗(yàn)對(duì)菌株BC80-6培養(yǎng)基的配方及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明培養(yǎng)條件的不同，碳氮無(wú)機(jī)鹽及其含量的不同對(duì)菌株BC80-6的活菌含量影響很大。優(yōu)化后的菌株BC80-6培養(yǎng)基成分及其含量與已報(bào)道的培養(yǎng)基成分具有差異，可能跟不同菌株的生活環(huán)境不同、所需要的營(yíng)養(yǎng)成分也不同有關(guān)。不同細(xì)菌的寄居環(huán)境不同，因而其最佳發(fā)酵條件也不同。優(yōu)化后的培養(yǎng)基成分較少、價(jià)格相對(duì)較低，而且是生產(chǎn)上較容易獲得的化工原料，因而在工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)中有一定的優(yōu)勢(shì)。
在溫室中測(cè)定了芽孢桿菌對(duì)煙草根黑腐病菌的控病試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌的防效為80.2%，與對(duì)照藥劑多菌靈和甲基托布津的處理效果無(wú)明顯差異。本試驗(yàn)中，菌株BC80-6對(duì)煙草根黑腐病的大田防效為88.19%，接近生產(chǎn)上使用的多菌靈和甲基托布津（分別為92.21%、89.66%）的防效。表明芽孢桿菌具有較好的生物防治能力，可用于煙草根黑腐病的生物防治。
4、結(jié)論
①在3種枯草芽孢桿菌BC80-6處理液對(duì)煙草根黑腐病菌菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)的抑制試驗(yàn)中，抑制效果最好的是10-1倍活菌液。②1.5%蔗糖、0.5%酵母浸出物、0.06%硫酸鎂（質(zhì)量體積比）是培養(yǎng)菌株BC80-6的最佳培養(yǎng)基配方。③在時(shí)間24 h、溫度28℃、初始pH 6.5、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、接種量5%、250 mL三角瓶裝液量40 mL的條件下，最有利于菌株BC80-6的發(fā)酵。④菌株BC80-6活菌液對(duì)煙草根黑腐病的大田防效達(dá)88.19%。
枯草芽孢桿菌BC80-6發(fā)酵培養(yǎng)基、生長(zhǎng)條件及對(duì)煙草根黑腐病菌生防作用（一）
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