紅曲霉發(fā)酵方法、生長曲線及工藝優(yōu)化
紅曲霉在發(fā)酵過程中產(chǎn)生莫納可林（Monacolin K），莫納可林能夠降低膽固醇，具有非常好的藥用價(jià)值。目前紅曲霉發(fā)酵生產(chǎn)莫納可林存在產(chǎn)量偏低、生產(chǎn)成本偏高等問題。碳源是構(gòu)成菌體和產(chǎn)物的碳架及能量來源，不同的碳源會通過影響菌體形態(tài)進(jìn)而影響所需產(chǎn)物的產(chǎn)量。氮源是構(gòu)成菌體細(xì)胞中核酸、蛋白質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)的主要成分，是菌體的生長發(fā)育和發(fā)酵代謝物的合成積累必不可少的物質(zhì)基礎(chǔ)。發(fā)酵基質(zhì)對于紅曲霉來說，是其生長、代謝、繁殖的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分會對紅曲霉的生長狀況和莫納可林的生成產(chǎn)生很大的影響。因紅曲霉個(gè)體小、代謝旺盛等特點(diǎn)，對生長環(huán)境的要求也相對較嚴(yán)格，外界環(huán)境的變化很容易影響到紅曲霉的代謝途徑，使其產(chǎn)物發(fā)生明顯的改變，所以通過控制紅曲霉發(fā)酵時(shí)的發(fā)酵條件來增加莫納可林的產(chǎn)量已經(jīng)成為一種現(xiàn)代微生物發(fā)酵技術(shù)常用的技術(shù)手段。公開號為CN107475301A的中國專利申請公開了一種高產(chǎn)紅曲色素和Monacolin K的功能紅曲的制備方法，所述方法通過在發(fā)酵過程中加入不同的金屬離子以及控制發(fā)酵溫度提高紅曲色素和莫納可林的產(chǎn)量。上述方法沒有從根本上去解決發(fā)酵培養(yǎng)基的成分影響紅曲霉的發(fā)酵生產(chǎn)莫納可林產(chǎn)量的問題。另外，影響紅曲霉發(fā)酵的外界環(huán)境因素有很多，不只是溫度的影響。因此有必要提出一種紅曲霉的發(fā)酵工藝優(yōu)化方法。
紅曲霉的發(fā)酵工藝優(yōu)化步驟：
步驟1：根據(jù)種子培養(yǎng)液制備基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入不同種類的碳源后發(fā)酵紅曲霉，測量基礎(chǔ)培養(yǎng)基中目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，生成第一產(chǎn)量柱形圖，確定發(fā)酵培養(yǎng)基的目標(biāo)碳源。種子培養(yǎng)液的pH為6.0，種子培養(yǎng)液包括：1克/升的酵母膏、1克/升的K2HPO4、0.01克/升的MgSO4·7H2O、0.01克/升的FeSO4·7H2O。在本實(shí)施例中，在多個(gè)250毫升的三角瓶中分別裝入80毫升種子培養(yǎng)液制備基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將三角瓶在121℃滅菌30分鐘，分別加入不同種類的碳源，接種等量的紅曲霉，在28℃下，150r/min搖床發(fā)酵12天后，測量基礎(chǔ)培養(yǎng)基中目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量生成第一產(chǎn)量柱形圖。碳源指的是能夠?yàn)榧t曲霉提供碳元素以支持其生長和代謝的有機(jī)化合物。碳源的種類包括葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、甘油、乳糖，選擇該6種碳源進(jìn)行實(shí)驗(yàn)獲取數(shù)據(jù)。目標(biāo)碳源為甘油。
目標(biāo)產(chǎn)物為莫納可林，測量基礎(chǔ)培養(yǎng)基中目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量的步驟：將發(fā)酵結(jié)束后的基礎(chǔ)培養(yǎng)基于50℃下烘干、粉碎得到發(fā)酵粉，加蒸餾水將發(fā)酵粉恢復(fù)至基礎(chǔ)培養(yǎng)基烘干前的體積得到發(fā)酵液，調(diào)整發(fā)酵液的pH為6.3，量取10毫升的發(fā)酵液，加入40毫升的甲醇，超聲反應(yīng)20分鐘，50℃水浴2小時(shí)，間歇振蕩3-4次，3000r/min離心3分鐘，經(jīng)0.45μm的濾膜過濾得到上清液，將上清液置于冰盒上通過高效液相色譜儀進(jìn)行檢測。除此之外，還可以通過雙波長法測量基礎(chǔ)培養(yǎng)基中目標(biāo)產(chǎn)物的含量，紅曲霉除了代謝生產(chǎn)莫納可林還會生產(chǎn)紅曲色素，紅曲色素會影響莫納可林的測量，利用紅曲色素在246納米和254納米波長處吸光值基本相同，而莫納可林在該兩處的吸光值存在明顯差異的特性，通過分光光度法測量基礎(chǔ)培養(yǎng)基在246納米和254納米處吸光值之差，從而有效的排除紅曲色素對測量的影響，達(dá)到準(zhǔn)確測量的目的。
步驟2：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的目標(biāo)碳源后發(fā)酵紅曲霉，測量基礎(chǔ)培養(yǎng)基中目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，生成第一產(chǎn)量曲線，確定目標(biāo)碳源的第一目標(biāo)濃度。最高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量所對應(yīng)的目標(biāo)碳源的濃度為第一目標(biāo)濃度。本實(shí)施例的第一目標(biāo)濃度為65毫升/升，即每升基礎(chǔ)培養(yǎng)基包含65毫升的目標(biāo)碳源。
步驟3：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入不同種類的氮源后發(fā)酵紅曲霉，測量基礎(chǔ)培養(yǎng)基中目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，生成第二產(chǎn)量柱形圖，確定發(fā)酵培養(yǎng)基的目標(biāo)氮源。氮源是指能夠?yàn)榧t曲霉提供氮元素的營養(yǎng)物質(zhì)，是構(gòu)成紅曲霉蛋白質(zhì)、核酸和其他重要含氮化合物的關(guān)鍵成分。氮源的種類包括蛋白胨、谷氨酸鈉、酵母粉、黃豆粉。選擇該4種氮源進(jìn)行實(shí)驗(yàn)獲取數(shù)據(jù)。除氮源外，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中還要加入等量的目標(biāo)碳源，在28℃下發(fā)酵12天。最高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量所對應(yīng)的氮源為目標(biāo)氮源。
步驟4：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的目標(biāo)氮源后發(fā)酵紅曲霉，測量基礎(chǔ)培養(yǎng)基中目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，生成第二產(chǎn)量曲線，確定目標(biāo)氮源的第二目標(biāo)濃度。最高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量所對應(yīng)的目標(biāo)氮源的濃度為第二目標(biāo)濃度。
步驟5：確定影響紅曲霉發(fā)酵的至少兩個(gè)基礎(chǔ)因子并生成因子集合，根據(jù)第一目標(biāo)濃度的目標(biāo)碳源和第二目標(biāo)濃度的目標(biāo)氮源制備發(fā)酵培養(yǎng)基。因子集合包括初始pH、溫度、接種量、溶氧量、培養(yǎng)時(shí)間。制備發(fā)酵培養(yǎng)基的步驟：在250毫升的三角瓶中裝入80毫升的種子培養(yǎng)液，然后將三角瓶在121℃滅菌30分鐘，最后加入第一目標(biāo)濃度的目標(biāo)碳源和第二目標(biāo)濃度的目標(biāo)氮源。
步驟6：在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵紅曲霉，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)得出基礎(chǔ)因子的高水平值和低水平值，從因子集合中篩選核心因子并生成核心因子集合，確定核心因子集合的組合高水平值。單因素實(shí)驗(yàn)是一種控制因子集合中的一個(gè)基礎(chǔ)因子為變量，其余基礎(chǔ)因子保持基準(zhǔn)值的實(shí)驗(yàn)。在本實(shí)施例中，因子集合中的各因子的基準(zhǔn)值為6.0、30℃、5%、80%、12天，初始pH的實(shí)驗(yàn)范圍為[3.0，6.0]、溫度的實(shí)驗(yàn)范圍為[25℃，37℃]、接種量的實(shí)驗(yàn)范圍為[5%，15%]、溶氧量的實(shí)驗(yàn)范圍為[65%，100%]、培養(yǎng)時(shí)間的實(shí)驗(yàn)范圍為[0天，16天]。最高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量對應(yīng)的因子變量的值為高水平值，低水平值為小于高水平值的因子變量的值。低水平值有多個(gè)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求和因子變量的實(shí)驗(yàn)范圍選擇高水平值附近的一個(gè)低水平值。遍歷的選擇因子集合中的一個(gè)因子作為因子變量，其余因子保持基準(zhǔn)值，設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)。
本實(shí)施例的初始pH的高水平值為5.0，低水平值為4.0；溫度的高水平值為28℃，低水平值為25℃；接種量的高水平值為10%，低水平值為5%；溶氧量的高水平值為96%，低水平值為65%；培養(yǎng)時(shí)間的高水平值為16天，低水平值為10天。通過設(shè)計(jì)普拉克特-伯曼實(shí)驗(yàn)，從因子集合中篩選核心因子并生成核心因子集合，進(jìn)行普拉克特-伯曼實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，另設(shè)至少一個(gè)空項(xiàng)進(jìn)行誤差分析，以目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量為響應(yīng)值，具體步驟在實(shí)施例二中進(jìn)行說明。通過最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，確定核心因子集合的組合高水平值，本實(shí)施例的組合高水平值為5%的接種量、95%的溶氧量、14天的培養(yǎng)時(shí)間。最陡爬坡實(shí)驗(yàn)是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的一種方法，主要用于探索響應(yīng)值最大所在的區(qū)域，這種方法是在普拉克特-伯曼實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)之后使用，以識別出對響應(yīng)值有顯著影響的因素，即核心因子集合，并確定核心因子集合的組合高水平值。
步驟7：控制多組發(fā)酵培養(yǎng)基保持核心因子的組合高水平值，發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行不同時(shí)間的發(fā)酵紅曲霉，生成紅曲霉生長曲線、目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量曲線、底物消耗曲線。發(fā)酵紅曲霉時(shí)，保持核心因子之外的基礎(chǔ)因子處于高水平值。通過高效液相色譜儀測量目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，通過生物傳感儀測量剩余底物的含量。
紅曲霉生長曲線
步驟8：擬合紅曲霉生長曲線、目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量曲線、底物消耗曲線，得出紅曲霉生長函數(shù)、目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量函數(shù)、底物消耗函數(shù)。邏輯斯蒂方程是典型的S型曲線，在描述紅曲霉菌體生長方面被廣泛應(yīng)用，效果較好，因此可以選用邏輯斯蒂方程對紅曲霉生長曲線進(jìn)行擬合得出紅曲霉生長函數(shù)。選用呂德金-皮雷特方程來描述紅曲霉發(fā)酵的目標(biāo)產(chǎn)物的生成規(guī)律，對目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量曲線進(jìn)行擬合得出目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量函數(shù)。采用呂德金-皮雷特型方程對底物消耗的過程進(jìn)行描述，對底物消耗曲線進(jìn)行擬合的得出底物消耗函數(shù)。紅曲霉生長函數(shù)
步驟9：根據(jù)紅曲霉生長函數(shù)得出第一時(shí)間，根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量函數(shù)得出第二時(shí)間，根據(jù)第一時(shí)間、第二時(shí)間和底物消耗函數(shù)確定發(fā)酵培養(yǎng)基的底物添加函數(shù)。底物添加函數(shù)a(t)=s(t)-s(t+Δt)，a為底物添加量，Δt為底物添加周期，Δt=1，t1＆lt;t＆lt;t2，t1為第一時(shí)間，t2為第二時(shí)間，第一時(shí)間為紅曲霉生長函數(shù)的生物量達(dá)到最大值時(shí)的最小發(fā)酵天數(shù)，第二時(shí)間為目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量函數(shù)的目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量達(dá)到最大值時(shí)的最小發(fā)酵天數(shù)。第一時(shí)間為6天，第二時(shí)間為15天。
步驟10：根據(jù)目標(biāo)碳源、第一目標(biāo)濃度、目標(biāo)氮源、第二目標(biāo)濃度、核心因子的組合高水平值和底物添加函數(shù)輸出紅曲霉的發(fā)酵參數(shù)。本實(shí)施例的發(fā)酵參數(shù)包括甘油濃度65毫升/升、黃豆粉3克/升、5%的接種量、95%的溶氧量、14天的培養(yǎng)時(shí)間、底物添加函數(shù)a(t)。通過紅曲霉的發(fā)酵參數(shù)從發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分、外界影響因素和底物添加三個(gè)方面優(yōu)化紅曲霉的發(fā)酵工藝。
有益效果：本發(fā)明通過基礎(chǔ)培養(yǎng)基對紅曲霉進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)尋找合適的目標(biāo)碳源和目標(biāo)氮源，以及目標(biāo)碳源的第一目標(biāo)濃度和目標(biāo)氮源的第二目標(biāo)濃度。通過發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵紅曲霉，篩選出核心因子集合，根據(jù)核心因子集合、核心因子的高水平值設(shè)計(jì)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定核心因子集合的組合高水平值。通過控制發(fā)酵培養(yǎng)基的核心因子保持組合高水平值，對紅曲霉進(jìn)行不同時(shí)間的發(fā)酵，生成紅曲霉生長曲線、目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量曲線、底物消耗曲線。對所述曲線進(jìn)行擬合得出紅曲霉生長函數(shù)、目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量函數(shù)和底物消耗函數(shù)。根據(jù)紅曲霉生長函數(shù)、目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量函數(shù)和底物消耗函數(shù)確定發(fā)酵培養(yǎng)基每天的底物添加函數(shù)，保證發(fā)酵培養(yǎng)基中的紅曲霉能有足夠的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵、生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物，同時(shí)避免營養(yǎng)物質(zhì)過多而使紅曲霉進(jìn)一步繁殖影響目標(biāo)產(chǎn)物的生產(chǎn)。
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