綜述葡萄球菌降低發酵肉中生物胺含量的三種機制（二）
2葡萄球菌降胺機制
隨著研究的深入，大量研究表明，肉制品中的葡萄球菌具有降低發酵肉制品中生物胺含量的作用，其途徑主要有3種：1）葡萄球菌具有生物胺氧化酶，可以將生物胺氧化成醛、氨和H2O2等物質，從而達到降胺的效果；2）葡萄球菌可以產生葡萄球菌素，葡萄球菌素作為一種細菌素具有抑制或殺滅產胺菌的能力，可以從根本上抑制生物胺的產生；3）葡萄球菌可以與其他菌株產生協同作用，更好地發揮降胺效果。因此可以考慮將通過安全性評價且符合發酵劑條件的葡萄球菌作為肉品發酵劑使用。在諸多降胺方法中，添加發酵劑也被認為是最有效的方法之一。圖1為發酵肉生物胺來源與形成以及利用葡萄球菌作為發酵劑降解生物胺的途徑示意圖。
圖1發酵肉中生物胺形成與葡萄球菌降解生物胺途徑示意圖
2.1生物胺氧化酶氧化降胺
已有研究報道，根據輔基類型不同，具有生物胺降解作用的主要有3種酶：胺氧化酶、胺脫氫酶及多銅氧化酶。胺氧化酶具有較強的底物特異性，可以針對性地降低發酵肉中生物胺含量。胺氧化酶最早由Yamada等在黑曲霉中發現，該研究報道，當菌株在以單胺或二胺作為單一氮源的培養基上生長時，在真菌菌絲體中可以形成一種銅胺氧化酶，該酶在磷酸鹽緩沖液中可保持其活性，在pH 6.0～7.0、溫度35℃時穩定存在，但溫度一旦超過40℃其結構就被迅速破壞。之后，從成晶節桿菌KAIT-B-007中分離純化出具有熱穩定性的組胺氧化酶，通過研究其酶學特性，根據原子吸收光譜結果顯示，每摩爾該酶含有1個Cu2+，并證明Cu2+對組胺氧化酶的活性有重要影響。
生物胺氧化酶屬于氧化還原酶類，是一種能夠氧化生物胺的特殊蛋白質。微生物學中根據輔助因子的不同將生物胺氧化酶分為2類：一種是含銅的胺氧化酶，另一種是含黃素的胺氧化酶。根據氧化生物胺氨基數目不同又可以分為單胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）、二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）和多胺氧化酶（polyamine oxidase，PAO）等。MAO多屬于含銅的氧化酶，由于最先發現的MAO以酪胺為底物，因此又叫酪胺氧化酶；DAO主要可對組胺和腐胺產生氧化作用，可用調節它們在組織中的水平；PAO是指所有能氧化多胺類物質的酶，是催化多胺氧化降解的主要酶。PAO不同于MAO與DAO，可以降解多種生物胺，如精胺、亞精胺與腐胺，因此利用PAO來降解發酵肉制品中生物胺的應用前景十分可觀。菌株降解1種以上生物胺的能力可能是由于菌株中同時含有幾種胺氧化酶，目前已發現葡萄球菌屬中的木糖葡萄球菌可產生組胺氧化酶和酪胺氧化酶，肉葡萄球菌可產生組胺氧化酶及MAO等，也證實了這一說法。胺氧化酶主要通過2種方式降解發酵肉中的生物胺：一種是利用MAO直接將生物胺降解成小分子物質，如酪胺等；另一種是肉制品中各種生物胺都有與之相對應的胺氧化酶，生物胺在胺氧化酶與其他酶共同作用下，通過一系列的生化反應轉化為相應的鹽類，如在腐胺氧化酶與腐胺轉氨酶的共同作用下可將腐胺轉化為4-氨基丁醛，4-氨基丁醛再在4-氨基丁醛脫氫酶作用下轉化為4-氨基丁酸，4-氨基丁酸通過氨轉移酶和脫氫酶的作用形成琥珀酸鹽，從而達到代謝腐胺的目的。
已有研究發現，發酵食品中含有生物胺氧化酶的微生物通常是乳酸菌屬與葡萄球菌屬中的某些菌種，如植物乳桿菌、木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌等。葡萄球菌屬中的鼠尾草葡萄球菌菌株不具有胺降解酶活性，該結果也表明菌的胺降解活性不是物種特異性的，而是菌株基因水平特異性的。從意大利香腸中分離出50株具有降解生物胺性狀的木糖葡萄球菌，菌株中的S79、S81、S90、S206組胺氧化酶活性尤為顯著，可以降低組胺含量，降幅達100%。對不同熏馬腸樣品中的44株產生物胺氧化酶菌株進行分離與篩選，篩選出具有氧化酶特性和對金黃色葡萄球菌、李斯特菌及大腸桿菌3種致病菌有良好抑制活性的菌株，且耐鹽性和耐亞硝酸鹽性強，在使用變性梯度凝膠電泳排除重復菌株后，通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定其減少生物胺的能力，最終，利用16S rDNA的V6～V8序列進行聚合酶鏈式反應擴增和測序后，發現菌株中腐生葡萄球菌和木糖葡萄球菌滿足要求，可產生物胺氧化酶。通過培養基顯色法和氧化酶實驗相結合，從發酵香腸中分離產生物胺氧化酶的優勢菌，并利用HPLC檢測產生物胺氧化酶菌株對生物胺的氧化降解能力，最終獲得4株符合發酵菌株標準并產生物胺氧化酶的葡萄球菌；通過16S rDNA分子鑒定，確定上述4株發酵菌株中有3株模仿葡萄球菌和1株表皮葡萄球菌，其中模仿葡萄球菌可顯著降低多種生物胺含量。利用含生物胺氧化酶的微生物來防止食品中生物胺的合成和累積并對食品中已存在的生物胺進行降解，對發酵食品的加工工藝以及營養和風味影響甚微，是控制發酵食品中生物胺含量最有效的方法之一。但目前針對生物胺氧化酶的應用主要在于其作為活性物質對動植物生理、病理學方面的治療功效，很少直接將其運用于食品發酵工藝中，也缺乏對生物胺氧化酶的酶學性質與應用特性的深入研究。
2.2葡萄球菌產生細菌素抑制其他產胺菌
細菌素是一種由細菌產生的抗生代謝產物，多是蛋白或多肽類化合物，主要由某些細菌的核糖體合成。細菌素的抑菌機制主要是為細菌素產生菌提供相對于其他菌株的生存優勢。1885年，某些葡萄球菌菌株在固體培養基上能抑制其他葡萄球菌生長這一現象被Babes發現，但由于當時研究條件有限，并未對此作出科學的解釋；直到1946年，由葡萄球菌產生的細菌素才正式被定義為葡萄球菌素。并非所有的葡萄球菌菌株都具有產細菌素能力，但有的葡萄球菌又可以產生一種或多種葡萄球菌素。葡萄球菌產細菌素的能力取決于菌株基因組中細菌素基因簇是否完整表達。迄今為止，主要的葡萄球菌素產生菌包括表皮葡萄球菌及金黃色葡萄球菌。大部分葡萄球菌素在抵抗細菌，包括一些病原菌方面具有廣譜性。由于葡萄球菌素具有殺死競爭菌并與免疫系統相互作用的能力，認為產葡萄球菌素是葡萄球菌作為益生菌的特性。
發酵肉制品中最常見的生物胺主要是腐胺和尸胺，組胺是最重要且毒性最大的生物胺之一，發酵肉制品中的生物胺氧化酶主要由脫羧酶陽性菌產生，主要有假單胞菌屬、腸桿菌屬、酵母菌、乳酸菌和腸球菌屬等。組胺含量取決于弧菌屬、發光桿菌屬、克雷伯氏菌屬和莫爾甘內拉氏菌屬微生物，酪胺主要與肉毒桿菌、腸球菌和彎曲乳桿菌有關，而腐胺和尸胺主要與腸球菌有關。這些微生物可能存在于原料和環境中，對生物胺的產生起著關鍵作用。研究不同碳源對傳統酸肉菌群結構與生物胺含量的影響，發現腐胺和尸胺主要由腸桿菌中的陰溝腸桿菌、沙雷氏菌產生，酪胺的生成主要與腸球菌有關。從314株菌株中篩選出不具有產生物胺能力的木糖葡萄球菌0538，發現其不僅具有降解組胺的能力，而且在體外具有細菌素抑菌活性，可以抑制地衣芽孢桿菌（一種產胺菌）的活性，且其在含有0.5 mmol/L組胺和0.5 mmol/L酪胺的磷酸鹽緩沖液中，24 h可以降解38.0%組胺和4.4%酪胺。表皮葡萄球菌素NI01在一定濃度范圍內對金黃色葡萄球菌、腸球菌。等具有強大的抗菌活性，通過抑制產胺菌的生理活性起降胺作用。從葡萄球菌3682中發現的細菌素Hyicin 3682不僅具有廣譜抗菌特性，而且在食品中具有潛在的防腐作用，可以延緩食品腐敗、減少食源性疾病的發生。目前已有研究表明，產細菌素的乳酸菌可用于防止香腸中病原菌生長，為之后利用葡萄球菌素抑制產胺菌的生長、降低發酵肉中的生物胺含量提供了參考。但目前利用葡萄球菌產生的細菌素來抑制其他產胺菌生長的具體研究還十分有限，需要進一步的探究。
2.3葡萄球菌協助其他菌株降胺
測定魚露中組胺、腐胺和尸胺含量，并對從樣品中分離的細菌胺降解活性進行評價。結果表明，33株細菌分離株中，8株具有降胺能力的菌株被進一步鑒定和評估，其中解淀粉芽孢桿菌FS-05和肉葡萄球菌FS-19對組胺的降解率分別為59.9%和29.1%，中間葡萄球菌FS-20和枯草芽孢桿菌FS-12對腐胺和尸胺的降解率分別可達30.4%和28.9%以上。發現，添加木糖葡萄球菌有助于戊糖片球菌進一步降低薩拉米香腸中生物胺的含量，較以單一戊糖片球菌作為發酵劑，組胺含量多降低14.55%，與不添加發酵劑組相比組胺含量降低32.20%。通過測定發酵香腸中酪胺和色胺含量，進一步證實復合發酵劑降解生物胺效果更佳，通過結合微生物菌落計數結果發現，木糖葡萄球菌主要通過抑制乳酸菌及其他雜菌的繁殖，從而為戊糖片球菌提供了適宜的生存環境，更加有利于其降解生物胺作用。在發酵香腸中使用費氏乳桿菌與腐生葡萄球菌組成的復配發酵劑，對組胺、腐胺、尸胺和酪胺的產生均有明顯抑制作用。將植物乳桿菌、木糖葡萄球菌作為發酵劑接種至香腸中，發現部分產生物胺的微生物，如腸桿菌豐度顯著降低，直接減少了香腸中生物胺（酪胺、腐胺、尸胺、組胺、2-苯乙胺和色胺）的含量，對硫代巴比妥酸反應物值等指標也有影響，進一步證明木糖葡萄球菌在保證樣品安全性的同時，還能促進風味物質的形成，得到高品質的風干香腸。將香腸乳桿菌、肉葡萄球菌和腸膜明串珠菌3種發酵劑以不同的組合方式接種到香腸中，發現香腸乳桿菌和肉葡萄球菌共同發酵香腸后，可以有效抑制色胺、腐胺、尸胺、組胺的生成；添加腸膜明串珠菌和肉葡萄球菌可以降低香腸中苯乙胺和酪胺含量，且這2種組合方式的復合發酵劑降胺效果均優于單獨使用肉葡萄球菌作為發酵劑。將木糖葡萄球菌與植物乳桿菌作為發酵劑添加入香腸中，發現單獨添加木糖葡萄球菌能降低酪胺、組胺和尸胺含量，降幅分別為21%、25%、22%，而接種混合發酵劑可以徹底降解苯乙胺和色胺以及86%腐胺、82%組胺、63%尸胺和43%酪胺。
3結語
生物胺已經成為肉制品中無法避免的一類風險物質，嚴格控制肉制品中生物胺的含量對于保障人體健康具有重要意義。控制發酵過程中相關的各種因素是降低生物胺含量的有力保障，利用微生物作為發酵劑來抑制發酵肉中的生物胺是近年來最有效的方法之一。葡萄球菌屬中的木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌等作為發酵肉制品中的優勢菌種，不僅有利于發酵肉的風味、色澤，而且對人體安全無害，因此成為降解發酵肉中生物胺的首要選擇，但是降解過程中胺氧化酶的催化機理以及與生物胺的結合位點仍有待進一步研究。為擴大發酵劑菌株在食品產業的應用前景和技術優勢，開發各種新型優良發酵劑以及各種混合發酵劑來全面、高效地降低發酵肉生物胺含量將成為今后的研究熱點。目前的研究主要集中于降胺菌株的最佳作用條件及降解效率，忽視了與發酵產品總體環境的協調性；此外，從實驗室研發到真正將這些降胺菌株應用于發酵食品生產這一過程的實現也仍需要考慮和探索。同時，目前我國乃至世界各國都缺乏對發酵肉制品中生物胺的詳細限量標準，急需科研人員在此方面開展系統研究，制定不同生物胺的限量。同時依據風險評定結果，建立合理的監測限量體系，規范生產管理，降低生物胺含量，提高產品質量和安全性，保障消費者身體健康。
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