土霉素菌渣無害化處理：篩選菌株的生長曲線及產(chǎn)蛋白酶條件（一）
土霉素菌渣是龜裂鏈霉菌(Streptomycesrimosus)發(fā)酵生產(chǎn)土霉素過程中產(chǎn)生的酸性固態(tài)廢棄物，是在土霉素提取過程中，加入草酸等試劑酸化過濾后產(chǎn)生的，因此呈酸性，主要含有土霉素生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基成分、生產(chǎn)用菌體和產(chǎn)品分離、提純所用的試劑以及殘留的土霉素等。2008年抗生素菌渣列入《國家危險廢物名錄》，禁止用作飼料或飼料添加劑。土霉素菌渣含水量高、熱值低，在烘干和焚燒過程中需要大量的外部熱量和燃料，因此其處置成本較高。我國雖沒有明文規(guī)定抗生素菌渣不能作為肥料使用，但其存在菌渣處理不完全、制備的有機(jī)肥可能含有的抗生素殘留或代謝中間產(chǎn)物，在生物體內(nèi)累積，產(chǎn)生抗藥性等潛在的生態(tài)風(fēng)險。如何在環(huán)境友好、安全的前提下，合理有效地利用菌渣是目前亟待解決的重要課題。
本研究通過篩選能夠耐受土霉素菌渣并能產(chǎn)生蛋白質(zhì)酶的菌株，旨在利用該菌株對土霉素菌渣進(jìn)行發(fā)酵處理，充分利用菌渣成分，獲得可再利用的發(fā)酵液，作為培養(yǎng)基成分重新利用于土霉素生產(chǎn)中，在節(jié)省資源的同時，達(dá)到菌渣的無害化處理目的。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1樣品
土霉素菌渣和土霉素菌渣堆肥，均由內(nèi)蒙古華曙生物科技有限公司提供。
1.1.2試劑與儀器
土霉素標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC≥95%)，；蔗糖、賴氨酸、Folin-酚試劑、茚三酮、重鉻酸鉀等試劑均為國產(chǎn)分析純。TU-1901紫外分光光度計；TGL-16K高速冷凍離心機(jī)；霉菌培養(yǎng)箱MJ-16085-III，；ZHWY2102C立式雙層恒溫?fù)u床。
1.2方法
1.2.1培養(yǎng)基的配制
5%菌渣培養(yǎng)基：稱取干燥的400目土霉素菌渣粉末5 g加到100 mL自來水中混勻，pH值自然，用高壓滅菌鍋滅菌121℃，20 min，備用。配制5%的菌渣固體培養(yǎng)基需要加入5 g瓊脂以確保凝固性。
10%菌渣培養(yǎng)基：稱取干燥的400目土霉素菌渣粉末10 g加到100 mL自來水中混勻，pH值自然，用高壓滅菌鍋滅菌121℃，20 min，備用。
察氏液體培養(yǎng)基：硝酸鈉3 g、磷酸氫二鉀1 g、七水硫酸鎂0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、蔗糖30 g、水1 000 mL。121℃，20 min滅菌備用。固體察氏培養(yǎng)基添加2%的瓊脂。
1.2.2菌株的篩選
用無菌水浸泡土霉素菌渣堆肥樣品，得到的浸出液在察氏培養(yǎng)基平板上進(jìn)行涂布，30℃下培養(yǎng)，獲得菌落。
將察氏培養(yǎng)基上生長出的不同單菌落，分別在5%菌渣固體培養(yǎng)基上劃線接種，在30℃條件下培養(yǎng)，分別獲得M-1、M-2的單一菌落。
1.2.3篩選菌株的生長曲線
制備孢子懸液：分別選擇在察氏培養(yǎng)基上長勢良好且孢子旺盛的M-1、M-2菌株，分別刮取孢子，用無菌水制成2.0×106個/mL的M-1和M-2的孢子懸液。
在裝有100 mL察氏培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，分別接入1 mL的M-1、M-2孢子懸液。每種菌做3組平行，每組13瓶。30℃、160 r/min搖床上培養(yǎng)。每隔12 h取出6瓶，5 000 r/min離心10 min，稱量菌絲濕重，繪制生長曲線。
1.2.4篩選菌株的酸、堿耐受性
分別配制pH值為2、3、4.5、6.5、7、8的100 mL/250 mL察氏培養(yǎng)基。分別接入1 mL的M-1、M-2的孢子懸液，每個梯度平行做3組，在30℃，160 r/min條件下培養(yǎng)6 d。5 000 r/min離心10 min，稱量菌絲濕重，考察菌株的土霉素耐受性。
1.2.5篩選菌株的土霉素耐受性
配制含有土霉素0、200、600、1 000、1 400和1 800 u/mL，pH 3的察氏液體培養(yǎng)基各100 mL，分別加入250 mL錐形瓶中。吸取1 mL的M-1、M-2的孢子懸液接入不同土霉素含量的察氏液體培養(yǎng)基中，在30℃，160 r/min條件下培養(yǎng)6 d。用5 000 r/min離心10 min，獲得濕菌絲，稱重，分析并比較土霉素對菌體生長的影響，考察其土霉素耐受性。
1.2.6菌株產(chǎn)蛋白酶條件的優(yōu)化
(1)菌株產(chǎn)蛋白酶活力的測定。以酪氨酸為標(biāo)準(zhǔn)物，F(xiàn)olin-酚試劑為顯色劑，在660 nm處測定吸光值，繪制酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程式為y=127.22x-1.948 8，R2=0.997 4。
取一支試管，加入1 mL酪蛋白溶液(2%，pH 6.5磷酸鹽緩沖液配制)，置入40℃水浴中預(yù)熱5 min，再加入1 mL 40℃預(yù)熱5 min的樣品溶液，混勻后在40℃水浴中保溫10 min。立刻加入2 mL 0.4 mol/L三氯乙酸，搖勻，保溫20 min。離心，吸取上清液1 mL，加入5 mL的0.5 mol/L碳酸鈉溶液，最后加入1 mL Folin-酚試劑，于40℃水浴中顯色20 min。在660 nm波長下測吸光度。
酶活定義為在40℃，pH 6.5條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 mg酪氨酸所需的酶量為1個酶活力單位(u)。
(2)菌株產(chǎn)蛋白酶條件的優(yōu)化。為了優(yōu)化產(chǎn)酶條件，以蛋白酶活力為依據(jù)，在察氏培養(yǎng)基中，對培養(yǎng)溫度、pH值和培養(yǎng)時間進(jìn)行研究。在菌渣培養(yǎng)基中，對菌渣添加量、接種量和裝液量等因素進(jìn)行研究。
1.2.7篩選菌株對土霉素菌渣的轉(zhuǎn)化
(1)菌渣整體質(zhì)量的變化。在含有100 mL 5%菌渣液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，分別加入8 mL的M-1、M-2的孢子懸液和無菌水，平行3組。在30℃、160 r/min條件下培養(yǎng)7 d。取出后在5 000 r/min條件下離心10 min，收集沉淀物。沉淀物在105℃條件下烘干至恒重，冷卻后精確稱量其重量。
(2)菌渣蛋白質(zhì)含量的變化。培養(yǎng)方法同上。取出后在5 000 r/min條件下離心10 min，收集沉淀物。沉淀物在105℃條件下烘干至恒重，用凱式定氮法測定其蛋白含量。
(3)菌渣的游離氨基酸變化影響。培養(yǎng)方法同上。取出后在5 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液，定容至一定體積，并測定其游離氨基酸含量。游離氨基酸的測定，以賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)物，茚三酮為顯色劑，在565 nm波長處測吸光值，得到回歸方程式為y=304.74x+7.299 1，R2=0.999 1。
2結(jié)果與分析
2.1菌株的篩選
分離純化獲得兩種霉菌，分別命名為M-1和M-2，菌落形態(tài)如下圖。經(jīng)初步鑒定M-1為米曲霉、M-2為綠色木霉。
圖1篩選菌株菌落形態(tài)
2.2篩選菌株的生長曲線
將篩選菌株接種到液體察氏培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一定時間后分別取樣測定菌絲濕重，以菌絲濕重值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，繪制生長曲線。由圖2可見，培養(yǎng)開始24 h后，兩種菌株的菌絲重量均急劇上升，此時菌種進(jìn)入快速增長期。在72 h時，菌株M-1到達(dá)增長高點，隨后菌絲濕重?zé)o明顯變化，進(jìn)入緩慢衰亡期；而菌株M-2在108 h時菌絲濕重達(dá)增長高點，隨后進(jìn)入衰亡期。
圖2篩選菌株生長曲線
2.3篩選菌株的酸、堿耐受性
由圖3可知，M-1和M-2分別在pH 3和pH 6.5表現(xiàn)出最佳的生長量，均呈現(xiàn)出良好的耐酸性。M-1耐酸性好于M-2。兩種菌對堿性環(huán)境耐受性較差。
圖3 pH值對菌體生長的影響
土霉素菌渣的pH在3.35到3.77之間呈酸性。兩種霉菌都可以在樣品的pH范圍內(nèi)生長，滿足了處理土霉素菌渣的必要條件。
2.4篩選菌株的土霉素耐受性
從圖4可知，M-1土霉素耐受性好于M-2。土霉素濃度低于1 800 u/mL時，對兩種霉菌的影響有限，兩株霉菌可以在較高濃度的土霉素環(huán)境下均生長良好。菌渣里土霉素殘留在416.6 u/mL左右，遠(yuǎn)低于1 800 u/mL的土霉素濃度，所以兩種菌株在處理土霉素菌渣時，不會被土霉素抑制繼而影響處理效率。
圖4土霉素濃度的變化對菌體生長的影響
2.5菌株產(chǎn)蛋白酶條件的優(yōu)化
2.5.1培養(yǎng)基初始pH對菌株產(chǎn)蛋白酶能力的影響
向100 mL/250 mL察氏培養(yǎng)基中，分別接入1 mL M-1、M-2孢子懸液，初始pH值分別設(shè)定為5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5，平行3組，在30℃，轉(zhuǎn)速為160 r/min條件下培養(yǎng)168 h，分別取樣測定酶活，考察pH值變化對產(chǎn)酶活性的影響，結(jié)果如圖5。
圖5初始pH對菌株產(chǎn)酶的影響
培養(yǎng)基初始pH值小于6.0時，菌株M-1和M-2均隨著pH值的增大其產(chǎn)蛋白酶活力快速增加，pH值大于7.0時，隨著pH值的增大其酶活力快速下降；菌株M-1在pH 6.0時，蛋白酶活力達(dá)到最高值，菌株M-1在pH6.5時其酶活達(dá)到最高。因此，菌株M-1和M-2產(chǎn)蛋白酶的最適初始pH值分別確定為6.0和6.5。
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