甘露聚糖對S.cerevisiae酵母菌株生長及抗氧化活性的影響（一）
葡萄酒釀造是以釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)主導的一系列復雜的微生物代謝和生物轉化過程，其細胞活力對發酵酒樣中代謝產物的形成具有重要影響[1]。S.cerevisiae生命周期較短，快速衰老會導致發酵不徹底，揮發性化合物的合成和分泌能力大大降低，從而嚴重影響葡萄酒的香氣與感官品質[2]。氧化應激是導致細胞損傷、衰老和死亡的主要原因之一[3]。S.cerevisiae具有一定的氧化應激反應能力，可以通過多種途徑保護自身免受各種脅迫，如通過抗氧化酶的水平，包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)等來體現其對氧化應激的適應性反應；也可以通過產生谷胱甘肽(glutathione，GSH)等非酶類自由基清除劑，保護細胞不被氧化[4-5]。甘露聚糖及其衍生物在體外可以高效清除多種自由基，其中清除超氧陰離子自由基的能力接近維生素C，具有良好的抗氧化活性[6]。RODRIGUEZ-NOGALES等[7]通過添加甘露聚糖和商業酵母制劑，增加了起泡葡萄酒的抗氧化性能。同時，外源性添加甘露聚糖對葡萄酒香氣復雜性和風格獨特性也具有積極影響。COMUZZO等[8]研究表明，添加低質量濃度的甘露聚糖可以增加葡萄酒中酯類物質含量，而較高質量濃度(500 mg/L)會增加羧酸含量，帶給葡萄酒不愉快的氣味。李惠琳等[9]比較了4種酵母多糖對霞多麗干白葡萄香氣的影響，結果顯示甘露聚糖可增加葡萄酒香氣的濃郁度和復雜性。總體而言，目前關于酵母甘露聚糖對葡萄酒香氣品質提升方面的研究較多，但關于甘露聚糖如何通過影響S.cerevisiae生長及抗氧化性，從而改變酒體香氣合成釋放的內在機制研究鮮有報道。
本研究以模擬葡萄汁為原料，考察外源性添加甘露聚糖對S.cerevisiae菌株生長及細胞完整性的影響，初步探討酒精發酵過程中S.cerevisiae菌株抗氧化活性的動態變化規律，以期為進一步研究甘露聚糖對葡萄酒發酵香氣的調控機制提供理論依據。
1材料與方法
1.1材料與試劑
釀酒酵母Aroma White，意大利Enartis公司；甘露聚糖MP 60，安琪酵母股份有限公司。
ATP酶、SOD活性測定試劑盒、活性氧(reactive oxygen species,ROS)、GSH、丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；纖維二糖、磷酸氫二銨、酒石酸氫鉀、檸檬酸、磷酸氫二鉀等試劑均為分析純，天津光復化工研究所。
1.2實驗方法
1.2.1模擬葡萄汁的配制
參考祝霞等[10]的方法。葡萄糖200 g/L、纖維二糖0.2 g/L、磷酸氫二銨1.5 g/L、酒石酸氫鉀2.5 g/L、L-蘋果酸3.0 g/L、檸檬酸0.2 g/L、磷酸氫二鉀1.14 g/L、硫酸鎂1.23 g/L。
1.2.2甘露聚糖對釀酒酵母菌株生物量和活力的影響
在2 L的模擬葡萄汁(2.5 L棕色罐)中，分別添加100、200、300、400、500 mg/L的甘露聚糖(編號分別為MP1～MP5)，以不添加酵母多糖為對照(CK)。按照推薦用量0.2 g/L接種Aroma White，25℃控溫發酵，每隔24 h測定模擬汁中酵母細胞的生物量(OD600)，繪制菌株生長曲線。每個樣品設置3組平行，結果取平均值。下同。
在模擬葡萄汁中分別添加100、200、300、400、500 mg/L(MP1～MP5)的甘露聚糖，以不添加酵母多糖為對照(CK)，25℃控溫發酵。根據前期預實驗結果，自接種開始2、4、7 d分別對應菌株生長的前、中、后期，參照文獻[11]酵母活力測定方法，檢測3個生長時期酵母菌株活力，分析甘露聚糖對S.cerevisiae細胞活力的影響。
1.2.3酵母細胞抗氧化活性測定
1.2.3.1酵母細胞中ATP酶活性測定
參照符安[12]的方法并做修改，收集酵母細胞，3 500 r/min離心10 min，傾倒上清液，用5 mL生理鹽水(0.9%)洗滌3次后稱重，加入生理鹽水，冰水浴超聲破碎(4℃，40%功率，開啟5 s，停止7 s，共計1 min)，制成0.063 g/mL的勻漿，按照試劑盒說明書進行測定。
1.2.3.2酵母細胞中SOD活性測定
收集酵母細胞，用20倍體積的PBS，1 000 r/min離心10 min洗滌酵母細胞。重復2次后，再加入20倍體積的生理鹽水以3 500 r/min離心10 min，冰水浴條件下超聲破碎，制成10%的細胞勻漿，再將勻漿稀釋5倍，按照試劑盒說明書進行測定。
1.2.3.3酵母細胞中ROS含量測定
取模擬汁，離心10 min收集細胞，用PBS洗滌2次，再用PBS重懸，按照試劑盒說明書加入熒光探針(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)，在最佳波長500 nm，最佳發射波長525 nm處進行熒光檢測。
1.2.3.4酵母細胞中MDA含量測定
參照1.2.3.2的方法制成10%的組織勻漿，再將勻漿稀釋5倍，按照試劑盒說明書進行測定。
1.2.3.5酵母細胞及模擬汁中GSH含量測定
取模擬汁發酵液10 mL，3 500 r/min離心10 min，取上清液，按照試劑盒說明書測定GSH含量。按照1.2.3.2的方法，制成10%的組織勻漿，進行酵母細胞中GSH含量測定。
1.4數據分析
使用Microsoft Excel 2007對試驗所得數據進行整理，使用IBM SPSS Statistics 19.0進行多重比較(Duncan法，P<0.05)，用平均值±標準偏差來表示實驗結果。