不同代次改良Frey氏液體培養基質控菌生長曲線結果比較
為探究改良Frey氏液體培養基質控菌CVCC2960滑液支原體(以下簡稱MS)生長規律，本試驗首次同時采用CFU計數、CCU測定和pH值測定的方法，比較不同接種濃度、接種體積和不同代次MS生長情況。結果顯示：5%與10%接種量的CCU測定結果峰值差異不明顯，但5%接種的CFU計數峰值更高，pH下降更慢；1～5代菌在生長曲線各階段的測定結果均無明顯差別；3種不同接種方式的測定結果顯示，用0.5 mL菌液接種9.5 mL培養基的方式更利于MS生長。本試驗為改良Frey氏液體培養基的質控標準化提供依據。
支原體污染是生物制品常見的污染源，給科研、疫苗生產及生物制品產業帶來許多麻煩，《美國藥典》、《歐洲藥典》及《中國獸藥典》二〇一〇年版三部中均有使用培養法進行生物制品支原體檢查的專題論述[1-3]，《中國獸藥典》二〇一〇年版三部規定滑液支原體、豬鼻支原體分別為支原體檢驗用培養基支原體改良Frey氏培養基、支原體培養基質控菌株[3]。通過測定不同培養時段的CCU，繪制出的MS生長曲線表明：其遲緩期為培養后6 h內，對數期為6～36 h，穩定期為36～54 h，衰老期為54 h之后[4]。而通過測定不同培養時段的CCU可以發現，MS培養過程中活菌濃度上升伴隨著pH值的降低，且pH值為6.9時濃度達到最高[5],但同時用以上三種方法對滑液支原體進行生長曲線研究國內尚未見報道。本試驗結合CFU計數法、CCU測定法和pH值測定法，以活菌濃度、生長滴度和菌液pH值為指標，比較不同接種濃度、體積和不同代次MS生長情況，對該MS生長特性進行了系統研究，以期為改良Frey氏液體培養基質控工作的標準化提供參考。
不同接種濃度和收獲時間差異比較
不同接種濃度活菌濃度和pH值的比較兩種濃度接種的MS各時間點的活菌濃度、生長滴度和pH值如表1、表2所示。從表1可以看出，5%濃度接種的MS接種后24 h活菌濃度達到峰值；生長滴度18 h達到峰值；菌液pH則持續下降，18～24 h降至7.0以下。從表2可以看出，10%濃度接種的MS活菌濃度24 h達到峰值；生長滴度18 h達到峰值；菌液pH持續下降，18～24 h降至7.0以下。
不同接種濃度生長曲線和pH值變化
比較兩種接種濃度MS生長曲線和pH值變化情況見圖1～圖3。從圖1可以看出，接種濃度5%的MS 6～18 h活菌濃度增長更快，18～30 h活菌濃度更高；從圖2可以看出，接種濃度10%的MS 18～24 h生長滴度更高，24～40 h生長滴度下降更快；從圖3可以看出，同為pH持續下降的情況下，10%下降更快。
滑液支原體1～5代菌生長滴度比較
1～5代菌0～40 h各時間生長滴度見表3，F1～F5分別表示1～5代菌，其生長滴度變化范圍從低代至高代依次為(105～108)、(106～5.5×108)、(106～109)、(106～5.5×108)、(106～109)CCU/mL、通過比較1～5代MS生長滴度差異(表4、圖4)，可以看出1～5代菌峰值均不小于1.00×108CCU/mL，其中，F3、F5峰值達1.00×109CCU/mL，1～5代菌生長滴度不小于1.00×108CCU/mL的生長時間區段重疊部分為24～30 h。
圖2不同接種濃度滑液支原體生長曲線圖(生長滴度CCU測定法)
圖3不同接種濃度滑液支原體pH值變化圖
圖4 1～5代菌生長滴度的對數圖
時間/hF1(CCU·mL-1)F2(CCU·mL-1)F3(CCU·mL-1)F4(CCU·mL-1)F5(CCU·mL-1)05.05×1055.50×1061.00×1061.00×1061.00×10661.00×1051.00×1061.00×1061.00×1065.50×106185.50×1075.50×1081.00×1085.50×1081.00×109241.00×1081.00×1081.00×1091.00×1085.50×108301.00×1081.00×1085.50×1081.00×1081.00×108345.50×1075.50×1061.00×1085.50×1075.50×106401.00×1075.05×1045.50×1071.00×1061.00×105
表4 1～5代菌生長滴度差異比較表
同傳代體積差異比較
從表5可以看出兩種傳代體積MS不同生長情況，在菌液濃度樣本重復次數相同(n=4)的情況下，3組傳代方式的MS平均活菌濃度依次為(6.6±2.1)×107、(5.6±0.4)×107、(13.3±2.5)×107CFU/mL。對3組實驗數據進行單因素方差分析，利用最小顯著差數法(LSD法)對3組平均值進行多重比較，結果顯示：組1和組2無顯著差異，組3分別和組1、組2之間存在極顯著差異(P<0.01)，就MS活菌濃度而言，組3傳代方式優于組1、組2，即用0.5 mL菌液接種9.5 mL培養基的方式更利于MS生長。
表5不同傳代體積滑液支原體活菌濃度表
注：用LSD法進行多重比較，同列標有不同大寫字母A、B者表示組間差異極顯著(P<0.01)，即組3與組1、組2組間差異極顯著；標有不同小寫字母a、b者表示組間差異顯著(P<0.05)，即組3與組1、組2組間差異顯著，標有相同小寫字母b者表示組間差異不顯著(P>0.05)，即組1、組2組間差異不顯著
討論與小結
傳代比例菌種傳代是常用的微生物試驗技術之一，細菌及支原體常用的傳代比例通常為10%，魏順在MS培養時，先將菌株復蘇，再以1∶9比例接種，通過肉眼判斷，當培養基由紅色變為橙色或泛黃色時收獲[6]，劉軼秋等則是將-20℃凍存的MS恢復原體積后，再按5%比例接種[4]。本試驗比較了5%與10%傳代比例的生長曲線，從結果來看，5%與10%兩種比例接種的MS，活菌濃度與生長滴度均呈先升高后降低的趨勢，二者活菌濃度峰值均出現在24 h，而生長滴度的峰值是18 h，二者生長滴度不小于108CCU/mL時間區段均為18～24 h，生長滴度峰值均差異不明顯，但傳代濃度5%與10%相比有兩點優勢，一是傳代比例下峰值活菌濃度高，前者近乎于后者2倍，差異明顯；二是5%傳代比10%傳代pH值下降慢，即比較同時間點pH值，5%傳代比例比10%傳代比例高，MS是一類對pH值較敏感的微生物，pH值低于6.8時極易死亡[7]，基于活菌濃度和pH值綜合考慮，建議在改良Frey氏培養基日常檢驗中，MS復蘇后，將5%作為傳代比例。
3.2收獲時間《中國獸藥典》規定，改良Frey氏培養基靈敏度試驗最小變色單位不小于108[3]，在日常檢驗中，為保證檢驗結果真實、客觀、有效，所使用工作菌液生長活性不能過高或過低，過高導致培養基檢驗敏感性低，過低則使敏感性高。選擇接種濃度為5%，培養18～24 h，生長滴度維持在108CFU/mL與109CFU/mL之間，理論上，可以在18～24 h內收獲菌液。每次試驗的菌種、環境、操作不盡相同，具體的收獲時機需要依賴pH值測定，周錦龍等發現，當pH值為6.9的時候，活菌濃度達到最高[5]，從本次試驗來看，pH值為6.95時為菌液發生變色的轉折點。基于以上綜合分析，建議菌液培養18～24 h內，菌液即將發生變色之時收獲。3.3菌種代次為保證檢驗過程中菌種均一、一致，《中國獸藥典》規定改良Frey氏液體培養基質控菌MS傳代不可超過5代[3]，鑒于此，本次試驗只針對1～5代菌進行比較。從結果來看，1～5代菌生長滴度不小于108CFU/mL,收獲時間段基本重疊于18～30 h(1代略顯遲滯)，但峰值會隨著代次增加而略有抬升，因為隨著傳代次數增加，支原體對培養基適應性更強，生長更好。通過分析，1～5代菌均可用作培養基質控菌工作菌液，但在實際工作中，可綜合考慮凍存菌種代次、保存時間等影響種子菌液活性的客觀因素，再科學確定工作菌液代次。
傳代體積傳代體積是培養基檢驗、生物制品生產等過程中一項重要技術參數，杜德艷等通過測定豬肺炎支原體在不同容積培養瓶中CCU值和pH變化值得出，菌種在小容量瓶培養與在萬瓶培養相比，生長更快，CCU值亦更高[8]，由于在改良Frey氏培養基日常檢驗中，所需要菌液量較少，故本試驗選取了3組菌液與培養基體積搭配。通過比較分析，“0.5 mL菌液+9.5 mL培養基”的傳代方式優于“0.1 mL菌液+1.9 mL培養基”和“0.2 mL菌液+3.8 mL培養基”，具有極顯著差異，而后兩者間無顯著差異，故在改良Frey氏培養基日常檢驗中，建議使用“0.5 mL菌液+9.5 mL培養基”的傳代方式。
本試驗首次結合CFU計數法、CCU測定法以及pH值測定法，通過活菌計數和pH值測定，確定了MS體適宜傳代比例、收獲時間、菌種代次以及傳代體積，為改良Frey氏液體培養基的質控標準化提供依據。