青藏高原凍土區(qū)培養(yǎng)基分離解磷菌的生長(zhǎng)曲線測(cè)定
本研究以青藏高原多年凍土區(qū)土壤為研究對(duì)象，利用有機(jī)磷和無(wú)機(jī)磷選擇性培養(yǎng)基分離解磷菌，通過(guò)測(cè)定菌株的溶磷圈、菌液中pH和上清液有效磷含量等指標(biāo)分析解磷菌的解磷能力，結(jié)合不同干旱梯度和溫度梯度培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)菌株的抗逆能力，以期為解決青藏高原凍土區(qū)磷限制問(wèn)題提供優(yōu)良的菌株資源，將對(duì)干旱半干旱凍土區(qū)生態(tài)恢復(fù)具有重要意義。
研究區(qū)域和樣品采集
研究區(qū)域位于西藏自治區(qū)那曲市安多縣唐古拉山口附近(32°33′10.66′′N,91°50′3.97′′E)，是典型多年凍土分布區(qū)。該區(qū)域海拔5 100 m，全年大風(fēng)日約100 d，年均降水量293–430 mm，年均氣溫?1.3–2.9℃[18]。區(qū)域內(nèi)主要植被為紫花針茅(Stipa basiplumosa)、火絨草(Leontopodium leontopodioides)、羽柱針茅(Stipa subsessiliflora)、青藏苔草(Carex moorcroftii)和墊狀駝絨藜(Krascheninnikovia compacta)。土壤發(fā)育程度較低，多為石灰性土。
2022年8月，在唐古拉山口附近，距109國(guó)道垂直距離100–150 m范圍內(nèi)采集0–10 cm的土壤樣品。通過(guò)五點(diǎn)取樣法采集2 kg土樣，并按四分法對(duì)采集的土樣進(jìn)行混勻。混勻后的土樣分成2份：一份4℃保存用于解磷菌株分離；另一份土樣風(fēng)干后過(guò)2 mm篩，用于全量養(yǎng)分測(cè)定。土壤pH值為8.2，有機(jī)碳含量為4.31 g/kg，全氮含量為3.08 mg/kg，全磷含量為0.53 g/kg。
1.2培養(yǎng)基
無(wú)機(jī)磷選擇性液體培養(yǎng)基(g/L)[19]：葡萄糖10.00，Ca3(PO4)2 5.00，(NH4)2SO4 0.50，NaCl 0.30，KCl 0.30，MgSO4·7H2O 0.30，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03，MnSO4·4H2O 0.03，酵母浸粉0.50，pH 7.0–7.5。
有機(jī)磷選擇性液體培養(yǎng)基(g/L)[20]：葡萄糖10.00，植酸鈣5.00，MgCl2·6H2O 5.00，MgSO4·7H2O 0.25，KCl 0.20，(NH4)2SO4 0.10，pH 6.8–7.0。
肉湯培養(yǎng)基(LB)(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母浸粉5.0，NaCl 10.0，pH 7.0–7.2。
固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入15.0 g/L瓊脂。
在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，上述所有培養(yǎng)基以及實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所需的蒸餾水和涂布器等需要121℃滅菌20 min。
菌株生長(zhǎng)曲線繪制
取OD600為0.1的菌懸液1 mL，轉(zhuǎn)接于50 mL的LB液體培養(yǎng)基中，在5、10、15、20、30℃條件下振蕩培養(yǎng)(180 r/min)，測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間下菌液的OD600值，并分別以培養(yǎng)時(shí)間和OD600值為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)繪制菌株生長(zhǎng)曲線。
菌株生長(zhǎng)曲線特征
菌株在不同培養(yǎng)溫度下的生長(zhǎng)曲線如圖1所示。在30℃時(shí)，5株解磷菌在培養(yǎng)12–22 h后進(jìn)入穩(wěn)定期(圖1A)。在10、15、20℃時(shí)，i6、i9L、Qb和Qo在培養(yǎng)50 h后進(jìn)入穩(wěn)定期(圖1B、3C、3D)。在5℃時(shí)，i6、i9L、Qb和Qo進(jìn)入到穩(wěn)定期大約需要培養(yǎng)100 h，i5則需要培養(yǎng)140 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期(圖1E)。進(jìn)入穩(wěn)定期的5株解磷菌OD600值比較結(jié)果顯示：Qb和Qo的OD600值在5–20℃時(shí)高于i5、i6和i9L的OD600值，在30℃時(shí)則低于i5、i6和i9L的OD600值。不同培養(yǎng)溫度下，進(jìn)入穩(wěn)定期的Qb和Qo的OD600值在15℃時(shí)最高(圖1)。
圖1五株解磷菌的生長(zhǎng)曲線
結(jié)論
本研究利用選擇性培養(yǎng)基從青藏高原多年凍土區(qū)土壤中篩選出3株解無(wú)機(jī)磷菌(i5、i6和i9L)和2株解有機(jī)磷菌(Qb和Qo)。基于16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，5株解磷菌均為假單胞菌屬(Pseudomonas)。然而，5株菌在解磷能力、抗干旱和耐低溫能力等方面存在顯著的差異。通過(guò)解磷菌的溶磷指數(shù)、上清液pH和有效磷含量的測(cè)定，揭示了Qb和Qo解磷能力強(qiáng)于i5、i6和i9L的解磷能力。通過(guò)PEG6000模擬干旱脅迫處理以及低溫培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株Qo較其他菌株具備更強(qiáng)的耐干旱和低溫的能力。本研究將為青藏高原多年凍土區(qū)土壤難利用性磷活化提供重要菌株資源，對(duì)于支撐青藏高原凍土區(qū)土壤修復(fù)和植物生長(zhǎng)具有重要意義。
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