源自丹麥奶酪鹽水的天然漢森德巴利菌菌株生長(zhǎng)曲線及抗真菌活性
霉菌污染是食品加工中的一個(gè)主要問題，它不僅會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失和食品浪費(fèi)，而且可能影響食品安全。在乳制品行業(yè)，當(dāng)奶酪與加工設(shè)備和空氣接觸時(shí)，霉菌污染會(huì)出現(xiàn)在整個(gè)奶酪生產(chǎn)過程中。霉菌生長(zhǎng)在奶酪成熟、儲(chǔ)存和配送過程中尤為明顯，這會(huì)導(dǎo)致奶酪質(zhì)量下降，包括可見和不可見的缺陷，例如霉菌定植、異味和霉菌毒素形成的潛在風(fēng)險(xiǎn)。因此，抗真菌化合物和潛在的生物防治劑越來(lái)越受到關(guān)注，以防止奶酪上污染霉菌的生長(zhǎng)。由于其簡(jiǎn)單的培養(yǎng)要求和有限的生物安全問題，酵母被認(rèn)為與生物防治應(yīng)用相關(guān)。許多酵母種類已被證明對(duì)霉菌具有拮抗活性，但主要用于控制果實(shí)采后病害。D.hansenii是一種嗜鹽酵母，在與大多數(shù)奶酪品種相關(guān)的酵母物種中占主導(dǎo)地位。之前的研究中D.hansenii菌株已被證明表現(xiàn)出不同的抗真菌作用，然而需要進(jìn)一步深入研究來(lái)探索這些作用。
之前的研究已經(jīng)確定了D.hansenii的獨(dú)特生長(zhǎng)特征和NaCl耐受性然而，從丹麥奶酪鹽水中分離出的菌株，它們抑制乳制品環(huán)境中霉菌污染物的潛在能力尚未得到探索。本論文研究人員對(duì)丹麥奶酪鹽水中分離出的D.hansenii菌株對(duì)不同污染霉菌的抗真菌活性。研究人員使用OcelloScope微生物動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)對(duì)檢測(cè)了不同D.hansenii菌株對(duì)污染霉菌的萌發(fā)和生長(zhǎng)的抑制能力，包括測(cè)定單一VOC的半數(shù)最大抑制濃度(IC 50)。
丹麥Biosense微生物生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的應(yīng)用
200μL含有104孢子/mLMEB加100μL從每個(gè)D.hansenii菌株收集的無(wú)細(xì)胞上清液或100μL酵母蛋白胨（每升溶液里面含有5 g菌蛋白胨，3.0 g酵母提取物，將作為對(duì)照的40 g NaCl，pH 5.3)裝入到96微量滴定板中，使用oCelloScope微生物動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)在25°C下測(cè)量48小時(shí)的生長(zhǎng)曲線來(lái)確定無(wú)細(xì)胞上清液對(duì)霉菌的抗真菌活性。使用了oCelloScope檢測(cè)系統(tǒng)。該系統(tǒng)的像距為4.90μm，光照曝光時(shí)間為2 ms。對(duì)流體樣品進(jìn)行延時(shí)掃描顯微鏡檢查，從而每2小時(shí)在每個(gè)孔中生成一系列6張圖像。通過使用UniExplorer中的表面積分割和提取(SESA)算法自動(dòng)生成生長(zhǎng)曲線。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
研究的結(jié)果表明D.hansenii的抗真菌活性是復(fù)雜的，并且可能是由幾種抑制性VOC的協(xié)同和/或相加作用產(chǎn)生的，而不是單一化合物的作用。同樣，已證明經(jīng)證實(shí)的生物防治酵母W.anomalus BS91和M.pulcherrima MPR3對(duì)包裝新鮮水果中的采后病原霉菌的生長(zhǎng)抑制是由VOC和CO 2的協(xié)同作用引起的。此外抑制鐮刀菌屬。在植物乳桿菌（以前稱為植物乳桿菌）的無(wú)細(xì)胞上清液中生長(zhǎng))已被證明不是由乳酸菌產(chǎn)生的乳酸單獨(dú)產(chǎn)生的。
圖1、在25°C下接種72小時(shí)后，添加4%(w/v)NaCl的MYGP肉湯的生長(zhǎng)和D.hansenii菌株的pH變化。
圖2、來(lái)自D.hansenii菌株KU-9、KU-10、KU-11、KU-12、KU-27、KU-28、KU-29、KU-30、KU-72、KU-78和KU-80對(duì)使用oCelloScope TM測(cè)量為標(biāo)準(zhǔn)化SESA單位的五種霉菌的生長(zhǎng)情況。(A)Cladosporium sinuosum，(B)鐮刀菌，(C)毛霉菌，(D)Cladosporium inversicolor，(E)Penicillium roqueforti。每個(gè)點(diǎn)代表三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，誤差條代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。(F)oCelloScope監(jiān)測(cè)C.inversicolor（藍(lán)色）和P.roqueforti（紅色）在酵母蛋白胨培養(yǎng)基（對(duì)照）中或在D.hansenii菌株KU-27的無(wú)細(xì)胞上清液存在下24小時(shí)的生長(zhǎng)測(cè)量實(shí)時(shí)圖像。這些研究結(jié)果表明D.hansenii無(wú)細(xì)胞上清液主要以霉菌物種依賴性方式影響萌發(fā)階段，而不是以D.hansenii菌株依賴性方式。
圖3、隨著時(shí)間的推移，在KNPS+精氨酸（紅色）、丙氨酸（綠色）或葡萄糖（藍(lán)色）中培養(yǎng)的婁地青霉菌的單個(gè)發(fā)芽分生孢子的像素中的Δ面積（面積t=x-面積t=1）。黑點(diǎn)顯示NPS+丙氨酸中正在發(fā)芽的A.niger分生孢子。
圖4、化合物的相對(duì)發(fā)芽率或菌絲生長(zhǎng)速率與相對(duì)峰面積之間的spearman相關(guān)系數(shù)散點(diǎn)圖。(A)y軸:羅氏白僵菌發(fā)芽率;x軸:乙酸峰面積;(B)y軸:羅氏白僵菌發(fā)芽率;x軸:3-甲基丁酸的峰面積;(C)y軸:逆色芽萌發(fā)率;x軸:丙酮峰面積;(D)y軸:逆色芽孢桿菌的發(fā)芽率;x軸:2-戊烷的峰面積;(E)y軸:逆色芽孢桿菌的萌發(fā)率;x軸:2-苯乙醇的峰面積;(F)y軸:逆色偃麥草菌絲生長(zhǎng)速率;x軸:2-苯乙醇的峰面積。
圖5、6、7天后五種VOCs對(duì)霉菌菌絲膜形成的抑制作用。為了確認(rèn)IC 50結(jié)果以及評(píng)估暴露于不同濃度的目標(biāo)VOC的長(zhǎng)期影響，隨后在培養(yǎng)7天后通過目視檢查對(duì)菌絲體表皮形成的完全抑制進(jìn)行評(píng)分。
總結(jié)
評(píng)估了從丹麥奶酪鹽水中分離出的天然漢森德巴利菌菌株對(duì)乳制品工業(yè)中的污染霉菌的拮抗活性。使用脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)測(cè)定染色體多態(tài)性揭示了D.hansenii菌株之間的巨大遺傳異質(zhì)性。應(yīng)用oCelloScope微生物動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)測(cè)試了11種D.hansenii菌株抑制污染霉菌的發(fā)芽和生長(zhǎng)的能力，這些霉菌經(jīng)常出現(xiàn)在丹麥的奶牛場(chǎng)，即黑枝孢菌、中華絨毛孢菌、燕麥鐮刀菌、總狀毛霉和羅克福提青霉。研究表明從丹麥鹽水中分離出的D.hansenii本地菌株對(duì)特定的污染霉菌具有拮抗作用，并指出D.hansenii菌株作為生物保護(hù)培養(yǎng)物的發(fā)展，針對(duì)奶酪鹽水和奶酪表面。
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